斜纹夜蛾GNBP1基因的克隆及诱导表达模式的研究

革兰氏阴性结合蛋白(Gram-negative bacteria binding proteins,GNBPs)是昆虫天然免疫系统中的一类重要模式识别受体,在识别病原微生物表面的相关分子模式中发挥着重要作用。为了解模式识别蛋白GNBP如何免疫应答病原微生物应激,本研究利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得斜纹夜蛾革兰氏阴性结合蛋白GNBP1基因(SlGNBP1)。斜纹夜蛾SlGNBP1基因(GenBank登录号:JF313110)全长cDNA序列为1 448 bp,开放阅读框(ORF)序列长1 302 bp,编码433个氨基酸残基。生物信息学分析序列表明SlGNBP1蛋白序列含有βGRP(β-1,3-glucan recognition protein)家族特有的保守性结构域,即糖苷水解酶活性结构域(Glyco_hydro_16),有3个N-糖基化位点,19个O-糖基化位点,42个磷酸化位点。系统进化树和同源性分析表明斜纹夜蛾SlGNBP1基因与其它鳞翅目昆虫的βGRP1基因的同源性很高,其中,斜纹夜蛾SlGNBP1基因与棉铃虫和柑橘凤蝶的βGRP序列相似度最高,相似度分别为79%和66%,SlGNBP1蛋白序列中有4个保守的半胱氨酸位点,富含12个色氨酸,由于两个葡聚糖酶活性位点突变而失去葡聚糖酶活性。利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测斜纹夜蛾SlGNBP1基因的时空表达模式,结果表明SlGNBP1基因在斜纹夜蛾整个发育历期都表达,其中4龄幼虫表达量最高;组织分布表明SlGNBP1基因在斜纹夜蛾的表皮、脂肪体、中肠、卵巢和血细胞中均有表达,其中脂肪体为主要表达部位。将绿僵菌、玫烟色棒束孢、金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和粘质沙雷氏菌6种病原微生物分别注射4龄斜纹夜蛾幼虫后,对SlGNBP1基因进行mRNA水平检测。RT-qPCR检测表明SlGNBP1在不同诱导时间点与对照相比,均呈现明显上调表达,但诱导程度不同,诱导18-24 h后达到峰值,且SlGNBP1基因对粘质沙雷氏菌最为敏感,与对照相比提高了约100倍。以上结果表明SlGNBP1基因可能在斜纹夜蛾先天免疫应答反应中通过识别病原微生物表面的相关分子模式而发挥作用,可能成为斜纹夜蛾生物防治的新靶标。

Cloning and induced expression profile of pattern recognition receptor GNBP1 gene of Spodoptera litura (Fabricius)