| 摘 要： | 目的:构建pc DNA3.1-Pax6过表达质粒并观察其对胶质瘤U251细胞增殖的影响。方法:以K562细胞c DNA为模版,采用RT-PCR的方法扩增Pax6基因,将扩增产物酶切回收后与同样酶切回收的真核表达载体pc DNA3.1连接、转化,构建pc DNA3.1-Pax6重组质粒,再经菌落PCR、酶切及测序鉴定重组质粒;利用脂质体lipofectamine 2000转染重组质粒至U251细胞。Real-time PCR检测Pax6 mRNA的表达水平,Western blot检测PAX6蛋白的表达,MTT法检测U251细胞增殖。结果:PCR扩增获得长度为1 131 bp的阳性产物,经pc DNA3.1真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pc DNA3.1-Pax6构建成功;Real-time PCR结果显示,Pax6过表达后的U251细胞Pax6 mRNA表达水平明显高于正常对照组;Western blot结果显示,PAX6蛋白表达亦明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(P0.05);MTT结果显示,与正常对照组细胞比较,转染pc DNA3.1-Pax6组的细胞,细胞增殖能力明显降低,差异亦具有统计学意义(P0.05)。结论:成功构建人Pax6基因的pc DNA3.1-Pax6重组质粒,过表达Pax6基因抑制U251细胞的增殖。
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