| 温度诱导Targetron系统用于大肠杆菌高效基因失活 |
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| 引用本文： | 赵行行,程玉梅,吴昌学,任玮,饶凤琴,周倩,崔古贞,齐晓岚,洪伟.温度诱导Targetron系统用于大肠杆菌高效基因失活[J].生物工程学报,2020,36(8):1659-1671. |
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| 作者姓名： | 赵行行 程玉梅 吴昌学 任玮 饶凤琴 周倩 崔古贞 齐晓岚 洪伟 |
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| 作者单位： | 1 贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室，贵州 贵阳 550004;2 贵州医科大学 附属医院ICU，贵州 贵阳 550004;3 贵州医科大学 免疫学教研室，贵州 贵阳 550004;4 贵州医科大学 微生物学教研室，贵州 贵阳 550025 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金 (Nos. 31560318，31760318)，贵州省自然科学基金 (Nos. [2020]1Z067，[2019]1441，[2018]1132，[2018]5779-17) 资助。 |
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| 摘 要： | 构建基于TeI3c/4c嗜热二型内含子的温度诱导Targetron基因失活系统 (Thermotargetron)，并应用于中温微生物基因编辑。在大肠杆菌HMS174 (DE3) 基因组中，选择Subunit of flagellum基因 (fliC) 和C4 dicarboxylate orotate:H+ symporter基因 (dctA) 为靶基因。根据TeI3c/4c DNA识别规则，在fliC和dctA基因中选择fliC489a、fliC828s、fliC1038s和dctA2a位点为基因打靶位点。使用重叠延伸PCR方法，基于pHK-TT1A质粒构建打靶载体。打靶载体转化HMS174菌株，对数期转化子培养液48 ℃热激1 h后涂布于氯霉素抗性LB平板上。使用菌落PCR和DNA测序检测突变株并计算基因失活效率。获得突变株后，通过琼脂穿刺和碳源代谢实验，鉴定ΔfliC、ΔdctA突变株表型变化。菌落PCR测序结果表明，TeI3c/4c插入到fliC和dctA基因设计位点，且打靶效率高达100%。突变株表型验证实验表明，ΔfliC突变株运动能力显著下降，ΔdctA突变株苹果酸代谢能力缺失。综上所述，文中建立了一套适用于嗜中温微生物的温度诱导型、高效基因失活系统，该系统可通过控制宿主菌在48 ℃保温时间实现高效、靶向、精准基因失活。
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| 关 键 词： | 嗜热targetron，Ⅱ型内含子，温度诱导，基因失活，大肠杆菌，fliC，dctA |
| 收稿时间： | 2019/12/9 0:00:00 |
A temperature-inducible Targetron system for efficient gene inactivation in Escherichia coli |
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| Xingxing Zhao,Yumei Cheng,Changxue Wu,Wei Ren,Fengqin Rao,Qian Zhou,Guzhen Cui,Xiaolan Qi,Wei Hong.A temperature-inducible Targetron system for efficient gene inactivation in Escherichia coli[J].Chinese Journal of Biotechnology,2020,36(8):1659-1671. |
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| Authors: | Xingxing Zhao Yumei Cheng Changxue Wu Wei Ren Fengqin Rao Qian Zhou Guzhen Cui Xiaolan Qi Wei Hong |
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| Institution: | 1 Key Laboratory of Endemic and Ethnic Diseases, Ministry of Education, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou, China;2 Department of ICU, The Affiliate Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou, China;3 Department of Immunology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou, China;4 Department of Microbiology, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou, China |
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