适用于链霉菌大片段基因组DNA 克隆和异源表达的细菌人工染色体(BAC)载体的构建及应用

【目的】很多链霉菌来源的天然产物的生物合成基因簇往往很大,用传统的cosmid载体很难完整的克隆和异源表达。本研究通过载体改造,成功构建出一个新的细菌人工染色体(BAC)载体,用于链霉菌来源的天然产物生物合成基因簇的克隆及异源表达实验。【方法】从复合型载体pCUGIBAC1出发,通过λRED介导的PCR-targeting方法,用链霉素抗性基因替换掉原有的氯霉素抗性基因标记,同时插入链霉菌中常用的安普拉霉素抗性标记、转移起始位点oriT、φC31整合酶基因int、整合位点attP等元件。【结果】成功构建出可装载链霉菌大片段DNA的BAC载体pMSBBACs。使用pMSBBACs构建出链霉菌U27的基因组BAC文库,平均插入片段大小为100 kb。选取其中一个大小为140 kb的BAC质粒进行功能验证,实验证明通过接合转移和原生质体转化的方法都能够将这个大型BAC质粒导入链霉菌模式菌株,并通过位点特异性重组整合到染色体中进行异源表达。【结论】BAC载体pMSBBACs可成功用于放线菌大片段基因组DNA的克隆和异源表达实验。