转基因鱼构建模式的研究 I．cMT—sGH全鱼基因鱼的构建与检测

转基因鱼工作的开展被用于水产科学基础与应用研究的各个领域。应用方面的一顶重要研究利用转生长激素基因来提高鱼的增长速度。需要解决两个问题：一是转基因鱼所使用的基因元件；二是外源基因的高整和率与高表达，已有许多报道认为：不同种动物的生长激素不一定相互促进生长。我们通过显微注射，将鲤鱼金属硫蛋白启动子（cMT）与大巴哈鱼生长激素基因（sGH）的融合基因（cMT-sGH)导入鲤鱼半日细胞后期的早期胚胎，构建了全鱼基因鲤鱼。通过斑点杂交、Southern blot结合PCR－Southern blot，对外源sGH的整和进行了精确的检测和分析。实验选取性成熟鲤鱼，收集卵子和精子，湿法受精获得受精卵。经过转基因注射，孵化后的鱼苗放入水族。待鱼平游，提取总DNA进行检测。以PstI酶切质粒pcMTsGH(Fig.4)分离3．4KbsGH片段，用随机引物标记，作为杂交探针。同时，设计并合成sGH基因的PCR特异引物。Fig.1的斑点杂交结果与Fig.2的PCR－Southern结果相比较（Table1)，说明斑眯杂交存在着高的假阳性。而PCR－Southen将PCR的快速、方便与Southern的准确性相结合，排除了PCR本身可能的非特异，大大提高了检测效率，同时也检验了引物的设计是否成功。Table1的结果表明：我们所构建的基因鱼达到了37．7％的高整和率，且稳定性好。高整和率的原因与所使用的基因元件有很大关系。Fig.3基因组的Southern行为－PstI和BglII酶切的杂交信号条带多、共迁移，说明基因的整和方式为多拷贝，可能伴有碱基修饰。这可能是表达率降低的重要原因。