基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法研究 |
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引用本文: | 庞正,李建东,李川,梁米芳,李德新.基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法研究[J].病毒学报,2013(4):432-436. |
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作者姓名: | 庞正 李建东 李川 梁米芳 李德新 |
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作者单位: | 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 病毒性出血热室 |
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基金项目: | 传染病防治重大专项—重大传染病应急处置检测平台(No.2011ZX10004-001,2013ZX10004-001) |
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摘 要: | 为了便于新发或罕见病毒性传染病的筛查检测,本研究利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒—发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒—登革病毒为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法。研究中通过梯度稀释的RNA病毒模拟样本中可能存在的不同丰度的病原体,样本核酸依次加工成单链cDNA、双链cDNA、T4DNA连接酶处理后的双链cDNA以及添加外源辅助RNA后合成并连接的双链cDNA形式,然后进行Phi29DNA聚合酶等温扩增,使用荧光定量PCR方法比较各种方法对RNA病毒核酸扩增的影响。结果显示,对于不同类型的RNA病毒模拟标本,多重置换扩增对于单链及双链cDNA的扩增效果有限,而双链cDNA经DNA连接酶处理后的扩增能达到6×103倍;在cDNA合成过程中加入外源辅助RNA,模拟样本中病毒基因组的扩增可达2×105倍,尤其是对含有低丰度病原体的模拟样本扩增效果的改善更为明显。本研究摸索建立了基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法,能够对样本中低丰度RNA病毒基因组实现有效扩增,可满足开展多种病原体筛查检测的需求。
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关 键 词: | 多重置换扩增 Phi29DNA聚合酶 RNA病毒 |
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