Sortase A介导的(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体高效立体选择性转化(S)-苯基乙二醇

【目的】以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的sortase A为"分子订书机",用于(S)-羰基还原酶Ⅱ分子之间的连接,获得催化功能与稳定性增强的氧化还原酶寡聚体,高效催化2-羟基苯乙酮,合成(S)-苯基乙二醇。【方法】从S.aureus基因组中克隆sortase A基因,在大肠杆菌中表达,通过镍柱和凝胶层析纯化重组酶,获得纯酶sortase A。通过基因工程手段在(S)-羰基还原酶Ⅱ的C末端添加GGGGSLPETGG序列,蛋白纯化获得(S)-羰基还原酶Ⅱ-GGGGSLPETGG,摸索了sortase A催化(S)-羰基还原酶Ⅱ-GGGGSLPETGG的分子连接,形成(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体的最佳条件,并研究了寡聚体酶学性质及生物转化(S)-苯基乙二醇的效率。【结果】(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体比酶活力为38.5 U/mg,比原始型(S)-羰基还原酶Ⅱ提高了6倍,最适反应温度为50°C,最适pH为6.0,在50°C放置1 h后酶活仍旧保持90%以上;蛋白质变性实验结果显示,(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体的变性温度为60.1°C,比原始酶提高了10°C;生物转化结果显示(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体在3 h内完全转化5 g/L 2-羟基苯乙酮,产生光学纯度为100%的(S)-苯基乙二醇,相比于重组大肠杆菌(S)-羰基还原酶Ⅱ全细胞催化时间缩短了16倍。【结论】本研究首次将sortase A应用于氧化还原酶的分子连接,显著提高了酶的催化效率和热稳定性,表明sortase在手性催化中有很大的潜在应用价值。