| 摘 要： | 【目的】22(R)-羟基胆固醇是藜芦甾体生物碱合成的重要前体,通过异源表达验证藜芦(Veratrum nigrum)中胆固醇C-22位羟化酶的功能,并构建酵母底盘生产22(R)-羟基胆固醇,为藜芦甾体生物碱的生物合成途径解析奠定基础。【方法】基于藜芦转录组数据,从藜芦根中克隆3条全长的CYP90B亚家族基因序列,构建到酵母Y33表达载体,并转入胆固醇酵母底盘进行功能验证。通过高效液相色谱、液相色谱-质谱联用仪检测酵母摇瓶发酵产物,筛选到具有胆固醇C-22位羟化酶催化功能的酶VnCYP90B27-1,利用多片段组装、同源重组和醋酸锂转化等方法将VnCYP90B27-1整合到酵母染色体,构建22(R)-羟基胆固醇的酵母底盘。【结果】实时荧光定量PCR(RT-qPCR)显示,3条候选基因在根和叶中的表达与转录组表达趋势一致,VnCYP90B27-1在藜芦根中的表达量极显著高于叶。系统发育树结果表明,VnCYP90B27-1与加州藜芦的VcCYP90B27和藜芦的VnCYP90B27有较高的同源性,同属于CYP90B亚家族。此外,酵母异源表达结果表明,VnCYP90B27-1具有胆固醇C-22位羟化酶功能,并成功实现酿酒酵母异源合成22(R)-羟基胆固醇,摇瓶产量达(5.37±0.37)mg/L。【结论】成功克隆并验证了藜芦22(R)-羟基胆固醇合成基因VnCYP90B27-1的功能,构建了22(R)-羟基胆固醇酵母底盘,证明在酿酒酵母中VnCYP90B27-1的催化活性比加州藜芦的VcCYP90B27高,为甾体生物碱异源合成提供基因资源。
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