| 谷氨酸依赖型氨基转移酶的高通量筛选方法及其应用 |
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| 引用本文： | 贺霖伟,刘璋敏,冯雁,崔莉.谷氨酸依赖型氨基转移酶的高通量筛选方法及其应用[J].中国生物工程杂志,2017,37(8):59-65. |
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| 作者姓名： | 贺霖伟 刘璋敏 冯雁 崔莉 |
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| 作者单位： | 上海交通大学生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室 上海 200240 |
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| 基金项目： | 国家"973"计划资助项目（2012CB721000） |
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| 摘 要： | 目的:建立谷氨酸依赖型氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应的96孔板高通量筛选方法,并用于大肠杆菌氨基转移酶Wec E突变库的筛选。方法:通过优化偶联指示酶-谷氨酸脱氢酶、信号分子NADH浓度及双酶偶联反应时间,建立了光学法测定氨基转移酶活性的氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应方法;通过定点饱和突变技术构建了大肠杆菌氨基转移酶WecE的突变库;采用96孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了高活性的转氨酶突变体,并对纯化的突变体进行催化活力分析。结果:建立了谷氨酸依赖型氨基转移酶目标反应与0.5 U/ml L-谷氨酸脱氢酶和0.4 mmol/L NADH信号指示反应相偶联的筛选方法;构建了氨基转移酶WecE Tyr 321饱和突变库,通过96孔板高通量筛选,获得了催化活性比野生型提高3.4倍的突变体Y321F。结论:所建立高通量筛选方法背景干扰小,准确性高,为谷氨酸依赖型氨基转移酶分子进化提供了可行性方案。
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| 关 键 词： | 谷氨酸依赖型氨基转移酶L-谷氨酸脱氢酶 分子改造 高通量筛选 |
| 收稿时间： | 2017-02-08 |
High Throughput Screening Method and Application for L-glutamate Specific Aminotransferase |
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| HE Lin-wei,LIU Zhang-min,FENG Yan,CUI Li.High Throughput Screening Method and Application for L-glutamate Specific Aminotransferase[J].China Biotechnology,2017,37(8):59-65. |
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| Authors: | HE Lin-wei LIU Zhang-min FENG Yan CUI Li |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | L-glutamate dehydrogenase Molecular evolution L-glutamate specific aminotransferase High throughput screening |
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