小干扰RNA对庚型肝炎病毒基因在人Huh-7细胞中表达的抑制作用 |
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引用本文: | 曹明媚,任浩,赵平,潘卫,赵兰娟,戚中田.小干扰RNA对庚型肝炎病毒基因在人Huh-7细胞中表达的抑制作用[J].中国科学C辑,2004,34(4):343-349. |
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作者姓名: | 曹明媚 任浩 赵平 潘卫 赵兰娟 戚中田 |
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作者单位: | 第二军医大学微生物学教研室,上海,200433 |
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基金项目: | 国家重点基础研究发展规划(973计划)项目(批准号: 2003CB514129),国家自然科学基金项目(批准号: 30170514)资助 |
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摘 要: | RNA干扰(RNAi)是由小干扰RNA(siRNA)引发的生物细胞内同源基因的转录后基因沉默现象, 是近年来兴起的一项研究生物基因调控与功能的崭新技术. 庚型肝炎病毒(HGV)是一单正链RNA病毒, 复制时不与宿主细胞基因组整合, 尤其适合用于RNAi的研究. 构建了含HGV完整结构基因并携带筛选标志潮霉素基因的真核表达载体pVAX.EH, 转染Huh-7细胞后, 筛选获得稳定表达HGV 结构蛋白的Huh-7细胞株(Huh-7-EH). RT-PCR和Western blot检测证实, HGV结构基因能在Huh-7-EH细胞中转录、表达, 并能进行剪切和翻译后修饰. 以体外转录法制备了2对靶向HGV E2基因的siRNA(1-E2 siRNA和2-E2 siRNA), 将其导入Huh-7-EH细胞中, 采用Western blot和克隆形成实验证实, HGV 1-E2 siRNA和2-E2 siRNA均能特异性抑制HGV结 构蛋白的表达, 抑制作用可维持1周以上. 其中2-E2 siRNA的抑制作用更强, 转染后对Huh-7-EH细胞潮霉素抗性克隆形成的抑制率达到了99%. Huh-7-EH细胞转染siRNA后对潮霉素敏感, 说 明HGV E2 siRNA不仅使HGV E2区的mRNA降解, 还可使融合在HGV E2区下游的潮霉素mRNA降解. 综上所述, 本实验建立的稳定表达HGV结构蛋白的Huh-7-EH细胞株, 能作为用于研究HGV复制和RNAi的细胞模型; HGV结构基因区的siRNA可同时抑制HGV结构蛋白及其下游的潮霉素基因的表达, 证明RNAi在真核细胞Huh-7-EH内可能存在放大作用.
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关 键 词: | 小干扰RNA 庚型肝炎病毒 结构基因 细胞模型 RNA干扰 |
收稿时间: | 2003-11-11 |
修稿时间: | 2003年11月11 |
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