TaqMan荧光定量PCR检测滑液囊支原体方法的建立及其感染鸡血液内载量测定

【背景】 滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae, MS)是禽类的常见病原,严重危害家禽养殖业的发展。MS易与其他病原混合感染,给临床诊断造成困难,因此亟须建立一种快速、准确、灵敏的检测方法对疑似患病禽进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】 建立一种检测MS的TaqMan荧光定量PCR方法,测定MS在感染鸡血液内的载量变化,为临床检测MS感染提供技术支持。【方法】 参考GenBank中登录的MS基因保守区域序列设计特异性引物和探针,以温度梯度qPCR法确定最适退火温度,用矩阵法优化其引物和探针加入量,通过提取MS 0801基因组作为模板构建标准曲线,并进行特异性、灵敏度、重复性试验,建立一种检测MS的TaqMan荧光定量PCR方法。使用建立的方法检测滴鼻攻毒和足垫攻毒后MS在感染鸡血液内的载量变化。【结果】 建立的TaqMan荧光定量PCR方法最佳退火温度为55 ℃,引物和探针(10 mol/L)加入量分别为0.8 mL和0.4 mL;扩增曲线具有良好的线性关系,R²>0.99;特异性强,仅对MS有特异性反应,对其他病原均无扩增反应;敏感性高,最低检测限为25 copies/μL;重复性好,批间试验和批内试验变异系数均小于2%。通过TaqMan荧光定量PCR检测MS在感染鸡血液内的动态变化,发现两个攻毒组MS含量的峰值和总体波动无明显差异,但足垫攻毒的MS在血液中的增殖要快于滴鼻攻毒。【结论】 本实验建立了一种能够快速检测MS的TaqMan荧光定量PCR方法,并用于检测MS在感染鸡血液内的动态变化,为临床上检测MS感染提供了技术支撑,为疫苗免疫评价方法提供了新的思路。