家蚕Piwi亚家族基因的克隆、表达及进化分析

为克隆家蚕Bombyx mori Piwi亚家族蛋白基因cDNA全长序列，分析其分子特征和表达模式，探究Piwi亚家族蛋白在家蚕中的生理功能，本研究利用已知物种的Piwi亚家族蛋白搜索家蚕基因组，预测获得家蚕Piwi亚家族蛋白基因siwi1和siwi2，采用RACE技术克隆siwi1和siwi2的全长cDNA序列，利用ORFfinder、Gene-Explorer、InterPro等分析其分子特征；其次，利用已知的所有物种Piwi蛋白及其类似物Piwil构建系统发育树；最后，通过荧光定量PCR技术检测了siwi1和siwi2在丝腺、马氏管、中肠、头部、卵巢和精巢以及不同发育时期（卵、1~5龄幼虫、蛹、成虫）的表达水平，结果显示，克隆获得了siwi1 cDNA全长3 277 bp，包含部分5′UTR、完整的开放阅读框ORF和3′UTR，获得了siwi2的部分序列，其中siwi1对应BmPiwi，siwi2对应BmAgo3。系统发育结果显示，家蚕Piwi亚家族蛋白与乳草长蝽Oncopeltus fasciatus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、橘小实蝇Bactrocera dorsalis、优雅蝈螽Gampsocleis gratiosa、斯氏按蚊Anopheles stephensi、褐飞虱Nilaparvata lugens的PIWI蛋白以及东亚飞蝗Locusta migratoria的PIWI2和PIWI3蛋白亲缘关系最近，和三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的PIWI2和PIWI3同为一支。家蚕AGO3蛋白与小菜蛾Plutella xylostella的AGO3亲缘关系最近，与西方玉米根虫Diabrotica virgifera virgifera、白蜡窄吉丁Agrilus planipennis的AGO3及东亚飞蝗Locusta migratoria的PIWI1同属一支，与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的AGO3同属一总支。组织表达结果表明BmPiwi在精巢表达水平显著高于其他组织，其次是卵巢及头部，而BmAgo3在头部表达水平显著高于其他组织。BmPiwi和BmAgo3在卵期表达量最高，但在初孵幼虫中表达量迅速下降，并在整个幼虫时期都维持低表达状态，直至蛹期开始表达量出现大幅回升，并维持高水平表达至成虫期。本研究发现BmPiwi和BmAgo3在家蚕中的表达具有明显的时空特异性，在生殖组织以及需要进行大量细胞活动的时期，家蚕Piwi亚家族蛋白基因的表达均发生了明显的变化，为进一步探测家蚕Piwi亚家族的生理功能提供了研究方向和理论基础。

Cloning, expression and phylogenetic analysis of Piwi subfamily gene in silkworm