DPC4/Smad4基因RNA干扰靶点设计和慢病毒载体制备*

摘要目的：DPC4/Smad4 基因RNA干扰靶点的设计和RNA 干扰靶点慢病毒载体制备。方法：针对DPC4/Smad4基因序列，并利 用网站设计程序，依据RNA干扰序列设计的原则，设计多个RNA干扰靶点序列。根据设计经验和设计软件将其进行评估测定， 选择最佳动力学参数靶点进入其后续的实验流程；生工生物合成含干扰序列的DNA oligo，具有严格的检测体系（PAGE 纯化体 系），其两端含酶切位点粘端，直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞，并且对长出 的克隆进行酶切鉴定。然后挑选出阳性克隆测序，进行测序比对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA 干扰慢病毒 载体。将构建的慢病毒载体以及辅助包装载体质粒共转染到293T 细胞。收获含有病毒的细胞培养上清，浓缩后进行滴度测定，并 检测其感染性。另外应用荧光实时定量PCR 检测在感染的293T细胞中敲减效果。结果：成功构建DPC4/Smad4 shRNA的慢病毒 载体LVshSmad4，并成功制备DPC4/Smad4 shRNA慢病毒，三株病毒感染细胞后均具有有效的敲减效应，其中SH1 最为显著。结 论：DPC4/Smad4 基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA 干扰靶点慢病毒制备，为以后探讨DPC4/Smad4 基因与肿瘤的相关性治 疗提供了实验基础。

Construction and Design of Lentiviral shRNA targeting DPC4/Smad4 Gene*