鹰嘴豆种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与鉴定

为了寻找具有药物作用的天然胰蛋白酶抑制物,采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析(DEAE-纤维素52)及Sephadex G-100凝胶层析等方法, 从鹰嘴豆种子中分离出一种鹰嘴豆胰蛋白酶抑制剂（CPTI）. 研究表明：CPTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制率达80%,而对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱,抑制率为32%, 对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制作用; 用SDS-PAGE测得CPTI近似分子质量为25.7 kD; CPTI具有较高的热稳定性,在100 ℃下加热60 min,对胰蛋白酶活性仍保持78%抑制率; Lineveaer-Burk作图得知该抑制剂属竞争性抑制类型. 动力学测定显示,来自鹰嘴豆中的CPTI对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为3.99×10^-7 mol/L.     

柘叶饲养对家蚕消化液中抗核多角体病毒（BmNPV）相关蛋白活性的影响

为探讨柘叶Cudrania tricuspidata饲养家蚕Bombyx mori易感染核多角体病毒（BmNPV）的机制, 本实验比较研究了分别以柘叶和桑叶Morus alba饲养家蚕后其消化液中抗病毒蛋白活性的差异。结果表明: 家蚕经柘叶饲养后消化液中红色荧光蛋白（red fluorescent protein, RFP）的强度无明显变化, 但柘叶饲养蚕消化液中脂肪酶、 胰蛋白酶的活性显著低于桑叶饲养蚕, 柘叶饲养蚕消化液中脂肪酶和胰蛋白酶的活性分别为1 421.71±202.60 U/L和19.67±8.17 U/mL, 桑叶饲养蚕脂肪酶和胰蛋白酶的活性分别为1 976.03±139.92 U/L和199.18±181.71 U/mL。这些结果说明, 消化液中脂肪酶和胰蛋白酶的活性水平低与柘叶饲养蚕易感染核型多角体病毒（BmNPV）可能相关。     

胰蛋白酶诱导人脐静脉内皮细胞分泌白细胞介素-8

目的:研究胰蛋白酶对IL-8释放的影响。方法:分离、培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、倒置显微镜观察形态变化,流式细胞术检测内皮细胞标志和蛋白酶活化受体-2(proteinase-activated receptor-2,PAR-2)表达,ELISA检测HUVECs培养上清中IL-8水平。结果:HUVECs表达内皮细胞标志和PAR-2。刺激16 h,1 g/ml胰蛋白酶和100M PAR-2激活肽组HUVECs单层均匀性降低。胰蛋白酶能够显著刺激HUVECs释放IL-8,PAR-2激活肽也诱导IL-8水平升高。蛋白酶抑制剂和PAR-2抑制肽均能够显著抑制胰蛋白酶诱导的IL-8释放。PAR-2激活肽和胰蛋白酶诱导升高的IL-8水平之间成正相关性。结论:胰蛋白酶很可能通过PAR-2激活促进血管内皮细胞释放IL-8。     

荞麦rBTI-2的表达及其对肿瘤细胞的生长抑制作用

设计一种适合基因工程开发的无标签重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI-2,并研究其对肿瘤细胞的生长抑制作用。构建原核表达载体pExSecI-BTI-2,诱导表达获得可溶性目的蛋白,经Resource~(TM) Q纯化后作用于HL-7702、HepG2、EC9706和QBC-939细胞,MTT检测rBTI-2对其生长的影响,并与前期获得的几种融合蛋白酶抑制剂进行功能比对。结果表明:质粒pEXSecI-BTI-2构建成功,SDS-PAGE分析表明分子量约为7.8 kDa。MTT检测表明rBTI-2对几种肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用,而对正常细胞HL-7702作用很小。几种蛋白酶抑制剂对肿瘤细胞的生长均有不同程度的影响,其中rBTI-2对肿瘤细胞的生长抑制作用要大于融合蛋白酶抑制剂rBTI,这为深入研究BTI诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制及其应用开发提供了重要基础和研究依据。     

桔黄赛多孢菌胞外胰蛋白酶的酶学特性

桔黄赛多孢菌Scedosporium aurantiacum是慢性肺病患者的常见呼吸道定植菌,在免疫缺陷人群中可引起侵袭性感染,致死率高,但由于致病机理不明,目前仍然缺乏有效的防控手段。我们在前期研究中,通过差异蛋白组学及酶工程技术发现分泌胰蛋白酶是桔黄赛多孢菌的潜在毒力因子,目前对这种蛋白酶的遗传信息、结构及致病机制并不清楚。本研究用Superdex S-200分子筛和DEAE-Sepharose离子交换两种填料将这种蛋白酶分离纯化出来,通过酶谱验证了纯化效果。进一步研究发现,这种胰蛋白酶对bFSR、bLSTR和bEKK 3种底物的水解性能最佳,对zFR和bzLR的水解性能最差。酶解最快的反应所对应的K_m为6.09μmol/L,V_max为13.01μmol/L/s,K_cat为23.65/s;酶解最慢的反应所对应的K_m为29.94μmol/L,V_max为11.35μmol/L/s,K_cat为20.63/s。研究结果对于填补赛多孢菌毒力因子研究的空白、针对毒力因子开发新型的抗真菌药物和治疗方法都具有重要意义。     

胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究

无菌采集健康牛胰脏,用0.125 mol/L的硫酸对牛胰脏进行预处理和保存,并对原材料的细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子进行检测,筛选合格原料.通过盐析、CM-Sepharose-FF层析、超滤等方法对胰蛋白酶进行提取和纯化.结果表明:经筛选原料提纯的胰蛋白酶通过细胞传代实验240 h后,细胞生长良好,形态正常,而未经筛选直接提取的胰蛋白酶通过细胞传代实验144 h后,细胞出现拉丝、病变等异常情况.     

组织中肥大细胞内F—actin对其不同亚型细胞分泌作用的影响

目的:研究细胞内丝状肌动蛋白的变化对不同亚型肥大细胞分泌作用的影响.方法: 利用肥大细胞的特征性蛋白酶抗体和鬼比环肽的免疫荧光标记;以流式细胞仪检测分选人皮肤组织中肥大细胞的亚型;使用激光扫描共聚焦显微镜显示肥大细胞内分泌颗粒和微丝的分布.结果:类胰蛋白酶免疫反应性的肥大细胞内含有丰富的丝状肌动蛋白环,在质膜内层区域形成阻碍类胰蛋白酶释放的屏障;大量的类胰蛋白酶暂存于分泌泡中,少量的类胰蛋白酶因细胞内丝状肌动蛋白环的解聚使之从分泌泡中释放.而类胰蛋白酶和类糜蛋白酶免疫反应性的肥大细胞及类糜蛋白酶免疫反应性的肥大细胞内少见或未见明显的阻碍蛋白酶释放的丝状肌动蛋白环;细胞形态膨胀,细胞内蛋白酶已释放.结论:人皮肤组织中肥大细胞内类胰蛋白酶和/或类糜蛋白酶的含量及其肥大细胞亚型与丝状肌动蛋白环相关联.     

鳜鱼胰蛋白酶和淀粉酶与胃蛋白酶原基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR及RACE法,克隆得到鳜鱼(Siniperca chuatsi)肝胰脏胰蛋白酶(trypsin, Try)、淀粉酶(amylase, Amy)基因 cDNA全序列.结果表明,鳜鱼Try基因cDNA全长为896 bp,其中开放阅读框 (open reading frame,ORF)为744 bp,编码247个氨基酸. 序列同源性分析发现,鳜鱼Try与 斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、 小鼠Try和人TRY氨基酸序列同源性分别为81.4%、75.3%、74.5%和71.4%.鳜鱼Amy 基因cDNA全长为1 647 bp,其中ORF为1 539 bp,编码512个氨基酸.鳜鱼Amy与斑马鱼 、非洲爪蟾、小鼠Amy和人AMY氨基酸序列同源性分别为79.7%、75.4%、71.9%和70.9%. 同时对鳜鱼基因组进行PCR,获得鳜鱼Try、Amy与胃蛋白酶原(pepsinogen, Pep)全基因组DNA序列.序列分析表明,鳜鱼Try基因由4个内含子和5个外显子组成,全长1 362 bp;鳜鱼Amy基因由8个内含子和9个外显子组成,全长4 267 bp;鳜鱼Pep基因由8个内含子和9个外显子组成,全长 4 032 bp,与其它脊椎动物基因结构相似.应用Genome walker方法在鳜鱼克隆得到长度分别为1 189 bp、413 bp和527 bp的Try、Amy和Pep基因的5′侧翼区序列以及1段长为704 bp的Pep 基因3′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个可调节其表达的调控元件.鳜鱼Try、Am y和Pep基因组全序列的克隆及其序列、结构分析和分子系统进化等的研究,为鱼类消化代谢相关基因的生理功能及表达调控机理进一步研究提供依据.     

应用双重免疫组化技术研究tryptase和IL-29与食管癌的相关性

目的:探讨食管癌组织中类胰蛋白酶(tryptase)和白细胞介素-29(interleukin-29,IL-29)的表达及其与食管癌的相关性.方法:采用双重免疫组化染色方法对87例食管癌根治术标本中hyptase和129进行检测,并探讨tryptase和IL-29双重染色的表达与食管癌的组织学分级、浸润深度及淋巴结转移之间的关系.结果:食管癌中tryptase的表达与食管癌组织学分级呈显著的负相关性,tryptase和IL-29双染均阳性表达与癌组织浸润深度亦呈负相关性.结论:癌间质内切印tase表达与食管癌分化程度有关.tryptase和IL-29均阳性的MC可能具有抑制食管癌生长的作用.tryptase和IL-29的表达与食管癌的生物学行为有相关性,对食管癌患者预后评估有一定的参考价值.     

超声对胃蛋白酶，胰蛋白酶，过氧化氢酶作用的研究

以胃蛋白酶,胰蛋白酶,过氧化氢酶溶液在超声处理下的酶活变化为指标研究超声对蛋白质作用的机理和影响因素。结果表明超声对蛋白质的破坏程度随着功率的升高或处理时间的延长而增加;三种酶在超声作用下酶活变化形式和程度各不同;浓度是影响超声对酶作用效果的一个重要因素,可通过调整酶溶液浓度来减少酶所受到的破坏程度。自由基清除剂甘露醇和非离子表面活性剂吐温-80可以对酶活在超声作用下起到一定的保护作用,说明自由基和超声空穴是超声破坏酶结构的重要机理,研究结果同时表明对于不同的酶,超声的破坏作用可能有不同的发挥主导作用机理。