云南省2006～2010年非脊灰肠道病毒分子流行病学特征分析

为了解云南省非脊髓灰质炎(脊灰)肠道病毒(NPEV)的基因型分布及分子进化特征,对2006～2010年间从急性迟缓性麻痹(AFP)病例中分离到的105株NPEVs进行VP1区部分核苷酸扩增和序列测定。所获得的云南地方株基因序列与各基因型原型株进行核苷酸与氨基酸同源性比较,并与GenBank中选取的代表株构建基因进化关系树。结果分析显示:105株NPEVs分别属于HEV-A、HEV-B、HEV-C,其中HEV-A 18株(7个血清型)所占比例为17.1%;HEV-B 77株(22个血清型)所占比例为73.3%,表明云南省AFP病例中流行的NPEV还是以HEV-B为主;HEV-C 10株(4个血清型)所占比例为9.5%;没有分离到HEV-D组肠道病毒;基因进化树中各种血清型病毒与对应原型株及代表株聚集一起,除CA2、EV90和EV76外,云南地方株与原型株位于不同分支。相同型别的毒株在5年的流行过程中变异程度亦不同,亲缘关系远近不一,表明这些病毒在云南省存在不同的传播链。     

实时细胞监测技术的人肠道病毒71型感染性检测方法研究

开展基于微电子传感器技术的实时细胞监测技术(Real-time Cell Assay,RTCA)在人肠道病毒71型(HEV71)病毒诱导的细胞病变检测方法中的应用价值研究。动态观察RD细胞不同阶段的生长指数,选择合适的细胞浓度开展HEV71病毒感染力和血清中HEV71中和抗体效价测定。同时应用传统的微量试验作为方法学的比较和结果验证。细胞阻抗通过软件转换成细胞指数CI值和可视的动态变化曲线显示,在96电子孔板上,当RD细胞浓度为1.5×104个/孔时能满足HEV71病毒感染性检测的观察天数大于5d的要求。与传统显微镜观察细胞CPE的方法比较,两种方法在接种病毒后的132h(约5.5d)产生病毒致细胞病变的终点判断结果一致。在中和抗体试验中,三份感染HEV71病毒的人血清中和抗体效价CI值结果和传统的96孔微量板镜检法结果相符。实时细胞监测技术可以提示研究者,即使是终点判断结果为相同的中和抗体滴度的血清,其所含病毒诱导的细胞病变出现时间也可能有所不同。实时细胞监测技术用于HEV71病毒感染力和血清中和抗体效价检测与传统的微量板法检测相比可以节省劳力,消除人为判断的误差,可以作为传统检测方法的补充手段之一,也可以动态观察细胞病变的发生和发展,为进一步深入研究病毒感染力强弱或血清抗体消长提供更为科学的数据。     

2010年内蒙古自治区手足口病病原谱及人肠道病毒71型分子特征研究

研究2010年中国内蒙古自治区引起手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的病原谱及人肠道病毒71型(Human enterovirus,HEV71)的分子特征。采集内蒙古自治区12个盟市门诊就诊的HFMD患者粪便和咽拭子标本共921份,进行病毒分离,然后利用三通道实时荧光定量PCR法[同时检测HEV71,柯萨奇病毒A16型(CVA16)和人肠道病毒(HEV)]对阳性分离物进行鉴定,对鉴定为其它HEV的阳性分离物进行VP4和VP1编码区扩增及核苷酸序列测定和分析。921份标本共分离出153株病毒,阳性率为16.61%,其中61株为HEV71,占39.87%,82株为CVA16,占53.59%,7株为其它HEV(分别为6株CVB4和1株Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗病毒株),占6.53%,3株为腺病毒。重症病例中分离到9株病毒,其中6株为HEV71,3株为CVA16。选取从临床诊断分别为普通型病例、重型病例的HFMD患者临床标本中分离到的32株HEV71代表株进行VP1编码区基因扩增及核苷酸序列测定和分析,与HEV71其它各基因型和基因亚型的代表株构建亲缘性进化树。32株内蒙古HEV71代表株与1998年以来中国大陆HEV71分离株的VP1区核苷酸和氨基酸水平上的同源性都较高,尤其与2008年的北京代表株同源性最高,与C4基因亚型代表株聚为一支,属于C4基因亚型C4a进化分支,但它们之间的核苷酸和氨基酸的同源性略有差异,分别为96.4%～100%和98.14%～100%,与2007年的内蒙古代表株存在一定的差异,核苷酸同源性为96.95%～97.87%。亲缘进化关系树显示,这些HEV71处于不同的簇中,属于多个病毒传播链。2010年内蒙古HFMD的病原谱以CVA16和HEV71为主,重症病例中以HEV71居多。内蒙古流行的HEV71属于C4基因亚型C4a进化分支,并且存在多个传播链,与2008年北京代表株亲缘关系比2007年内蒙古代表株亲缘关系近,说明内蒙古流行的HEV71不是独立进化的,而是与中国流行的HEV71在共同进化。     

TLR3和TLR4基因多态性与EV71感染手足口病严重性及易感性的关系研究

手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)是5岁以下婴幼儿常见的病毒性肠道传染病,该病主要由人肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)型及柯萨奇A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)引起,但关于TLR3、TLR4基因多态性与EV71感染手足口病的报道较少。为探讨EV71感染手足口病患儿TLR3和TLR4基因多态性与EV71感染手足口病严重性及易感性的关系,本研究选择2016年8月至2017年8月就诊于安徽医科大学第一附属医院的EV71感染手足口病患儿166例,其中重症组76例,轻症组90例,并选择同期来院体检的健康者120例作为对照组。收集患者入院时的年龄、性别、发热天数等基线资料,采集血液检测白细胞计数(White blood cell count,WBC)、丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Glutamate transaminase,AST)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清C反应蛋白(C reactive protein,CRP)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)水平;分离外周血单个核细胞提取DNA,琼脂糖凝胶电泳检测DNA情况;聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增TLR3c.1377C/T和TLR4-896A/G,限制性内切酶Tap I(TthHB8 I)、Nco I分别酶切TLR3、TLR4 PCR扩增产物,凝胶成像系统记录实验结果,对扩增产物进行测序,分析其基因多态性结果。结果显示,对照组与EV71感染组TLR3c.1377C/T位点的基因型分布与C、T等位基因频率均无显著统计学意义(P0.05);EV71感染组中重症组TT基因型较轻症组显著升高(P0.05);重症组T等位基因频率显著高于轻症组(P0.05),C等位基因频率显著低于轻症组(P0.05);EV71感染组中,TLR3c.1377C/T位点不同基因型患儿在年龄、性别及ALT、AST、CKMB水平上无显著差异(P0.05);TLR3c.1377C/T位点TT型患儿的发热时间及WBC、CRP水平显著高于CT和CC型,CT型患儿的发热时间及WBC、CRP水平显著高于CC型(P0.05);CC型患儿的IFN-γ水平显著高于CT和TT型(P0.05);TLR4-896A/G基因电泳条带为140bp的特异性扩增产物,为野生型Asp/Asp基因型,对照组和EV71感染组均未出现A→G的突变。本研究得出结论,TLR3c.1377C/T位点有CC、TT、CT三个基因型,且携带T等位基因EV71感染手足口病患儿进展为重症的风险较高;TLR4-896A/G基因无突变,与EV71感染手足口病患儿疾病严重性和易感性无关。     

新型病毒衣壳结合剂 哌嗪新衍生物抑制肠道病毒71型的复制

目的研究哌嗪新衍生物体外对肠道病毒71型(EV71)的抑制作用。方法培养EV71感染的人横纹肌肉瘤RD细胞,建立体外病毒感染模型,将哌嗪新衍生物作用于RD细胞,通过Western blot、Real-time PCR和病毒滴度检测细胞内EV71病毒蛋白和mRNA的表达水平及培养基上清中子代病毒颗粒的数量;并且观察细胞病变效应(CPE),采用CCK-8法检测哌嗪新衍生物对细胞活性的影响。结果哌嗪新衍生物VP1-4浓度为5μg/mL能够显著抑制RD细胞中EV71 VP1蛋白的表达,EV71 mRNA水平降低了(93.8±3.1)%,IC_(50)约为0.016μg/mL,培养基上清病毒滴度降低了(51.1±0.8)%;而且VP1-4能够减缓EV71病毒感染引起的CPE。此外,化合物VP1-4 CC_(50)200μg/mL,说明细胞毒性低,安全性较高。结论本研究证实VP1-4能有效抑制EV71的复制,可以作为先导化合物开展进一步研究。     

肠道病毒71型致神经元病变的机制研究进展

中枢神经系统感染是由病原体侵犯中枢神经系统引起的一类具有较高的发病率和死亡率的疾病。病毒是引起中枢神经系统感染的重要病原体之一,其中肠道病毒71型在继发神经系统症状的重症手足口病患儿中较为常见。EV71致神经元病变是其感染中枢神经系统的基础,阐明肠道病毒71型致神经元病变的机制,不仅可以促进基础病毒学研究,也能为抗病毒药物的开发提供思路,对临床肠道病毒71型致中枢神经系统感染的治疗提供支持。本文主要从肠道病毒71型侵入神经元的受体途径、损伤神经元的线粒体途径、诱导凋亡与自噬、感染胶质细胞后对神经元的旁观者效应、免疫病理机制以及病毒自身因素等多个方面,对肠道病毒71型致神经元病变机制展开综述。     

对人肠道病毒及其感染的再认识

长期以来,由于人肠道病毒种类众多,以隐性感染为主,引起的疾病症状从轻到重、表现多样,病原检测手段有限等原因,人们对人肠道病毒及其感染的基础与临床研究缺乏全面了解和认识。随着病毒学、分子生物学等技术的发展,特别是近年来各国频发人肠道病毒所致手足口病的流行,有必要对其及所致疾病再认识。     

EV71结构蛋白VP0的表达及抗体的制备

目的:原核表达EV71结构蛋白VP0(VP2+VP4)并制备其多克隆抗体.方法:以肠道病毒71型(EV71)全基因组为模板,设计引物扩增出目的片段VP0,将其克隆至表达载体pET-30a(+),并转化大肠杆菌TG1,筛选出阳性克隆后进行测序.将重组表达载体pET-30a (+)-VP0转入大肠杆菌表达菌株Rosetta中.该重组菌经过IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE电泳和Western Blot验证后,有与预期分子量大小一致的蛋白条带,并且主要以包涵体的形式存在.包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备了VP0多克隆抗体,并对该抗体进行了细胞免疫荧光分析.结果:经过大肠杆菌重组表达并纯化得到了纯度较高的VP0蛋白,制备的多克隆抗体经过细胞免疫荧光的验证表明反应性良好.结论:成功地表达VP0蛋白并制备了其多克隆抗体,有利于EV71病毒的检测及下一步对其疫苗的研究.     

肠道病毒71型疫苗质量控制研究进展

手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)已成为西太平洋区严重的公共卫生问题之一,肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起HFMD的主要病原体,研发疫苗是控制HFMD流行的有效手段。目前世界范围已有5个EV71全病毒灭活疫苗进入临床试验,其中中国研制的3种EV71疫苗已分别完成III期临床试验,结果表明3种疫苗都具有良好的安全性和保护效果。在EV71疫苗研发中,抗原质控的方法和标准是研发的瓶颈,其中抗原活性测定是工序工艺优化、免疫原性评价和剂量确定的关键指标。综述了EV71疫苗抗原质控的研究进展。