RNA-蛋白质印迹筛选HBsAg转录后调节因子表达克隆

RNA结合蛋白是基因表达的重要调节因子.RNA-蛋白质印迹（Northwestern blot）是近年来国外建立的筛选这类因子的重要方法之一.应用这一方法从肝细胞株HepG2 cDNA文库中成功筛选到乙型肝炎病毒表面抗原转录后调节片段互相作用蛋白表达克隆.结果显示：该蛋白与探针结合特异性强,经三轮筛选后,100%克隆为阳性克隆;PCR和EcoRⅠ酶切初步鉴定, 编码该蛋白的cDNA长约1 kb.     

NS5B与HCV负链RNA 3′末端特异性结合的分析

NS5B是RNA依赖性RNA聚合酶，在病毒RNA合成过程中起到中心催化酶的作用，在肠杆菌中表达和提纯了GST－NS5B融合蛋白，应用紫外交联试验（UV cross-linking）检测NS5B与丙型肝炎病毒（HCV）负链RNA3′末端的结合，确定NS5B是否参与HCV负链与HCN负链RNA3′末端复制体的形成。NS5B可与HCV负链RNA3′末端发生结合，这种结合存在量效关系， 比与正链RNA3′UTR X区的结合强约10倍，超大量的非同源性RNA和蛋白质不能竞争抑制S5B与负链RNA3′末端的结合，证明这种结合存在特异性。结果提示NS5B是HCV负链RNA3′末端复制体的成分之一。     

实时荧光定量PCR技术在SPF鸡四种垂直传播疾病监测中的应用

目的探讨荧光定量PCR检测技术对SPF鸡四种垂直传播病毒的检测应用。方法采集60份SPF鸡及70份普通鸡群蛋清、泄殖腔试子样品,提取样品核酸,分别进行ARV、REV、CAV、ALV四种病毒实时荧光定量PCR检测,根据标准曲线及溶解曲线分析判读样品病毒拷贝数。结果 SPF鸡ALV 2份阳性,检出率3.3%,其余病毒检测均为阴性;普通鸡样品REV检测2份阳性,检出率2.9%,ALV 10份阳性,检出率14.3%。结论荧光定量PCR检测方法最低可检测到100个拷贝核酸,检测灵敏度较高,有望应用于SPF鸡临床样品的病原检测。     

金鱼草基因转化和转基因植株再生

本实验采用根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐ３５ＳＧＵＳＩＮＴ与金鱼草下胚轴切段共培养,将ＧＵＳ基因导入金鱼草细胞,通过不定芽发生途径获得抗Ｇ４１８再生植株．经ＤＮＡ／ＤＮＡ斑点杂交及ＧＵＳ活性原位组织检测初步证实外源基因ＧＵＳ已整合进金鱼草基因组并得到表达．     

NS5B与HCV负链RNA 3＇末端特异性结合的分析

NS5B是RNA依赖性RNA聚合酶,在病毒RNA合成过程中起到中心催化酶的作用.在大肠杆菌中表达和提纯了GST-NS5B融合蛋白,应用紫外交联试验(UVcross-linking)检测NS5B与丙型肝炎病毒(HCV)负链RNA3＇末端的结合,确定NS5B是否参与HCV负链RNA3＇末端复制体的形成.NS5B可与HCV负链RNA3＇末端发生结合,这种结合存在量效关系,比与正链RNA3＇UTRX区的结合强约10倍,超大量的非同源性RNA和蛋白质不能竞争抑制NS5B与负链RNA3＇末端的结合,证明这种结合存在特异性.结果提示NS5B是HCV负链RNA3＇末端复制体的成分之一.     

与丙型肝炎病毒复制中间体3′末端结合的宿主蛋白的研究

宿主细胞蛋白在HCV复制过程中起着重要的作用.应用蛋白质-核酸紫外交联法检测多个细胞株,目的是明确是否存在可与HCV复制中间体3′末端特异性结合的细胞蛋白质.结果显示,在多个细胞株中存在一个分子质量约为45 ku的蛋白质（命名为p45）,可与HCV复制中间体3′末端131～278 nt结合,这种结合可被过量的自身未标记RNA竞争抑制,而非同源蛋白和非同源RNA均不能竞争抑制这种结合.根据计算机RNA二级结构分析推测,p45可能特异性结合于HCV复制中间体3′端的一茎环结构内.这一结果提示,p45在HCV子代RNA复制中可能起着重要作用.