2010年山东省环境污水中脊髓灰质炎病毒的监测及其基因特征分析

本研究在山东省开展了脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)的外环境监测,从济南、临沂两地采集污水标本,浓缩处理后进行病毒分离,对分离到的PV采用中和试验进行血清定型,并对其VP1及3D区进行序列测定,分析其基因突变和重组情况。2010年,共采集污水标本32份,PV阳性10份,阳性率31.3%;分离到18株PV(PV1型3株,PV2型9株,PV3型6株),均为疫苗相关株,VP1完整编码区核苷酸变异数在0~4个之间,在3株PV2型病毒和4株PV3型病毒的基因组中发现重组;对VP1区影响神经毒力的减毒位点分析发现,PV1型病毒中有1株在nt 2 749发生突变(A→G),PV2型病毒中有1株在nt2 908发生A→G突变,3株在nt2 909发生U→C突变,6株PV3型病毒全部在nt2 493发生C→U突变。环境污水中可以分离到PV,其基因重组率和主要减毒位点的回复突变率较高,未发现脊灰野毒株和疫苗衍生株脊灰病毒(Vaccine-derived poliovirus,VDPV)。     

1株人乳头瘤病毒6型山东地方株的全基因组序列分析

人乳头瘤病毒6型(Human papillomavirus type 6,HPV6)是引起生殖器疣与复发性喉乳头瘤的主要病原体之一.为明确2019年济南市1例尖锐湿疣患者的病毒基因组序列特征,本研究提取其尖锐湿疣组织标本总DNA,分两段进行HPV6全基因组PCR扩增和步移法Sanger测序,将拼接后的序列与全球36条不同来源的HPV6全基因组序列进行对比分析.结果 显示,1013/19/JN/CHN/HPV6株(以下简称1013/HPV6)基因组全长8031bp,属于变异谱系B1,与全球不同地区HPV6分离株序列的同源性为98.4％～99.9％.1013/HPV6株与B1亚谱系参考株AF092932全基因组序列相比具有19个核苷酸变异位点,分布在7个开放阅读框架(Open Reading Frames,ORFs)和非编码区内.本研究首次分析了分离自中国大陆的HPV6全基因序列特征,研究结果为HPV分子进化的进一步研究和分型诊断试剂的优化提供了数据.     

柯萨奇病毒A9型山东地方株的进化遗传学特征

柯萨奇病毒A9型(Coxsackievirus A9,CVA9)是常见的人类肠道病毒血清型,其感染可引起无菌性脑膜炎、脑炎等疾病.为探索其进化遗传学特征,本研究对山东省1991-2018年CVA9分离株的VP1完整编码区进行了序列测定,并与GenBank中获得的全球序列一并进行系统发生学和进化遗传学分析.结果 显示全球CVA9可分为Ⅰ-Ⅻ 12个基因型,优势基因型为Ⅶ,包括山东株在内的所有中国分离株均属于该基因型.进化遗传学研究显示,CVA9 VP1区序列的每年每个碱基的平均进化速率约为6.25×10-3,共同祖先起源于1919年.CVA9 VP1区的基因多样性在2003年以前无明显变化,2003年以后出现明显波动.本研究为我们了解CVA9的流行趋势和遗传变异提供了数据,对CVA9相关疾病的防控和诊断试剂的研发具有重要的现实意义.     

人类肠道病毒74型山东地方株的全基因组序列分析

人类肠道病毒(HEV)74型是人类肠道病毒B组(HEV-B)的新成员。为了解其进化和重组特性,本研究对2005年山东省急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis,AFP)监测系统分离到的人类肠道病毒74型山东地方株05293/SD/CHN/2005进行了全基因组序列测定和分析。与GenBank中的另2株HEV74全基因组序列比对,发现在5’NTR和3’NTR区有核苷酸缺失和插入;核苷酸序列的同源性分别为80.8%和80.6%,氨基酸同源性为96%和95.9%。山东株与原型株USA/CA75-10213间P1、P2和P3区核苷酸同源性分别为81.5%、80.0%和79.7%,氨基酸同源性分别为95.9%、96.0%和96.2%;山东株与西藏株Rikaze-136间P1、P2和P3区核苷酸同源性分别为81.9%、78.8%和79.5%,氨基酸同源性分别为95.9%、96.1%和95.7%。通过系统发生树和同源重组分析,发现该病毒可能与其他HEV-B组肠道病毒间发生重组。     

基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究

为了解生活污水中诺如病毒(Norovirus,NoV)检出情况、基因型分布和分子流行病学特征,进一步探索环境监测技术用于研究病毒性胃肠炎病原区域性流行的必要性,本研究于2016年1～12月在山东省济南和临沂两地采集生活污水,通过阴离子膜吸附洗脱法对收集到的24份污水样品进行浓缩后,提取核酸,经过逆转录-聚合酶链反应扩增NoV VP1基因片段,经TA克隆后测序,进行分型和系统进化树分析。结果显示,监测地区生活污水标本中GⅠ的检出率为100%,GⅡ为95.8%。共获得412条NoV序列,分别属于6个GⅠ基因型和8个GⅡ基因型,其中GⅠ.6(32.3%,133/412)、GⅡ.3(14.1%,58/412)和GⅡ.17(25.7%,106/412)检出数量最多。GⅡ.17检出序列均属于Kawasaki 308变异株,而前些年大流行的GⅡ.4的检出序列占比仅1.0%,属于Sydney 2012变异株。本研究描述了2016年山东省本地流行的诺如病毒基因型分布和序列特征,证明了可以通过对城市污水进行监测来探索人群中循环的诺如病毒的遗传多样性。     

山东省急性出血性结膜炎病原学鉴定及其柯萨奇A24病毒基因特征分析

为明确2010年引起山东省青岛市、临沂市急性出血性结膜炎(Acute hemorrhagic conjunctivitis,AHC)流行的病原,采集26例患者的眼结膜拭子标本,分别采用实时荧光定量PCR(Real time-PCR)和细胞培养方法进行检测。Real time-PCR结果显示,17份标本柯萨奇病毒A组24型(Coxsackievirus A24,CVA24)阳性,阳性率为65.39%,肠道病毒70型(Enterovirus 70,EV70)和腺病毒均为阴性;使用Hep-2细胞共分离到10株病毒,通过VP1区基因扩增及核苷酸序列测定,10株病毒均鉴定为CVA24,同源性分析显示其核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%～100.0%和99.5%～100.0%,在系统进化树上聚集成一簇,本次分离的毒株与山东省急性弛缓性麻痹(AFP)病例中分离到的毒株序列差异较大,分别属于5个不同的进化分支。提示CVA24可能为引起两地AHC流行的病原,且属于同一传播链。     

硫酸酯酶2型基因体内表达促进5-氟脲嘧啶诱发的小鼠骨髓抑制恢复作用研究

采用半定量RT-PCR和重组基因体内表达法观察了硫酸酯酶2基因(Sulfatase 2,Sulf2)在5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil, 5-Fu)诱发的小鼠骨髓抑制和再生过程中作用.结果表明:Sulf2在小鼠骨髓抑制和再生过程中呈现先上升,后下降的动态表达;电转pcDNA3.1-Sulf2基因实验组外周血白细胞数和血小板数在5-Fu注射后第7天分别为(1216.7±457.9)/μl和(8.1±5.4)万/靗,明显低于对照组[分别为(1691.7±228.9)/μl和(14.7±2.1)万/μl],实验组单条腿骨髓细胞总数在第7天为(94.2±21.1)万,显著低于对照组(173±59.9)万,但在第11天为(585±337.9)万,又显著地高于对照组(255±65.3)万,实验组第7天10000个骨髓细胞总集落形成数为(9±8.4),显著低于对照组(39±12.2),统计均有显著性差异(p<0.05).这些结果提示Sulf2可能对5-Fu诱发的小鼠骨髓抑制后的再生具有促进作用.     

硫酸酯酶2型基因体内表达促进化疗药物诱发的小鼠骨髓抑制恢复作用研究

采用半定量RT-PCR和重组基因体内表达法观察了硫酸酯酶2基因（Sulfatase 2,Sulf2）在5-氟脲嘧啶（5-Fluorouracil, 5-Fu）诱发的小鼠骨髓抑制和再生过程中作用。结果表明：Sulf2在小鼠骨髓抑制和再生过程中呈现先上升，后下降的动态表达；电转pcDNA3.1-Sulf2基因实验组外周血白细胞数和血小板数在5-Fu注射后第7天分别为(1216.7±457.9)/μl和(8.1±5.4)万/μl，明显低于对照组［分别为(1691.7±228.9)/μl和(14.7±2.1)万/μl］，实验组单条腿骨髓细胞总数在第7天为(94.2±21.1)万，显著低于对照组（173±59.9）万，但在第11天为(585±337.9)万，又显著地高于对照组（255±65.3）万，实验组第7天10000个骨髓细胞总集落形成数为(9±8.4)，显著低于对照组（39±12.2)，统计均有显著性差异（p<0.05）。这些结果提示Sulf2可能对5 Fu诱发的小鼠骨髓抑制后的再生具有促进作用。