龙眼体细胞胚胎发生过程中DlWUS的克隆与表达分析

以龙眼‘红核子’LC2悬浮细胞系诱导的胚性愈伤组织为基本材料,按照龙眼体细胞胚胎同步化方法诱导获得龙眼体胚不同阶段材料,并以龙眼体细胞胚胎发生不同阶段混合材料作为试验材料,采用RT-PCR结合RACE技术分离并克隆龙眼中编码同源异型结构域蛋白的转录因子WUSCHEL(简称DlWUS)的cDNA全长及DNA序列,并进行序列分析与表达分析。结果表明:DlWUS的cDNA全长1 110bp,开放阅读框(ORF)858bp,共编码285个氨基酸(GenBank登录号为KM017506),DlWUS的DNA包含2个内含子。序列分析表明,DlWUS是一个不稳定的亲水蛋白,不含信号肽,亚细胞定位于细胞核,具跨膜结构和Homeodomain超级家族的保守结构域以及WUS转录因子家族特有的WUS box和EAR-like结构域,推测该目的基因确实为WUS转录因子。系统进化分析显示,龙眼DlWUS与脐橙WUS归为一个分支,亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析结果表明,在龙眼体细胞胚胎发生整个过程中,DlWUS均有表达,但仅在球形胚时期表达量较高,说明DlWUS可能主要在球形胚阶段发挥作用,并且在一定浓度范围内,外源施加IAA和GA3能够促进DlWUS基因的表达,而外源施加SA则抑制DlWUS基因的表达。     

3种农杆菌对茶树发状根诱导的影响

以茶树‘福云6号’和‘铁观音’成熟种子下胚轴、未成熟种子下胚轴和愈伤组织为材料,以发状根诱导率为指标,探究菌液浓度、农杆菌菌株、外植体类型和预培养时间对发状根诱导的影响。结果表明:(1)菌液浓度OD600在0.4~1.2范围内,‘福云6号’成熟种子下胚轴发状根诱导率先升高后降低,ATCC15834在OD600为0.6时发状根诱导率最高为23.96%,A4和K599在OD600为0.8时,发状根诱导率最高,分别为10.51%和13.11%。(2)3种发根农杆菌致根能力不同,ATCC15834侵染力最强,致根能力大小依次为ATCC15834>K599>A4。(3)发状根诱导率与外植体有关,茶树成熟种子下胚轴可被诱导产生发状根,诱导率‘福云6号’大于‘铁观音’,未成熟种子下胚轴和愈伤组织难以产生发状根。(4)不经预培养和预培养时间为1~2 d的愈伤组织易褐变,无法产生发状根;预培养3 d的愈伤组织经侵染可产生发状根,诱导率为1.85%(‘福云6号’)和0.59%(‘铁观音’)。(5)PCR琼脂糖凝胶电泳检测和GUS组织化学染色证实GUS基因已被整合进‘福云6号’和‘铁观音’愈伤组织和成熟种子下胚轴发状根基因组中并表达。研究发现,发根农杆菌ATCC15834在OD600为0.6时,对茶树‘福云6号’成熟种子下胚轴发状根诱导率最高。该研究结果对改进发根农杆菌介导的茶树遗传转化系统提供理论依据,对茶树高效遗传转化体系的优化和新型受体的开发具有重要意义。