花椒窄吉丁触角转录组及嗅觉相关基因分析

【目的】建立花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi成虫触角转录组数据库,挖掘嗅觉相关基因,为今后研究其触角的化学感受机制及生物防控提供理论支撑。【方法】采用高通量测序平台IlluminaNovaSeq 6000对花椒窄吉丁雌雄成虫触角进行转录组测序,用Trinity软件对获得的高质量reads进行序列拼接与组装;使用BLAST软件将触角转录组数据比对NR, NT, Swiss-Prot, GO, KEGG, BLASTX,eggNOG, Pfam, TmHMM, SignalP, KO, Map, BLASTP和RNAMMER公共数据库;基于初步筛选到的花椒窄吉丁候选气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)和化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)以及其他鞘翅目昆虫的同源蛋白的核苷酸序列,利用MEGA软件进行系统进化分析。运用RPKM (reads perkilobase per million mapped reads)值对嗅觉相关基因表达量进行分析。【结果】花椒窄吉丁雌雄成虫触角转录组测序共获得36 209条基因和90 982条转录本,其N₅₀分别为2 103和2 523 bp,组装完整性较高。注释到NR数据库的基因最多(41.62%),其中与赤拟谷盗Tribolium castaneum相似基因所占比例最高(19%)。在GO数据库中比对到11 614个基因,按功能分为细胞组分、分子功能与生物学进程三大类57个分支,其中分子功能大类中的结合(70.57%)与催化活性(45.51%)相关基因占比最多;KEGG代谢途径分析表明,7 427条基因参与了5类代谢通路,其中涉及信号转导的基因最多,为815条;筛选到7个候选OBP基因和5个具有全长开放阅读框的CSP基因,其编码蛋白均具有化学感受蛋白家族的典型特征。系统进化分析表明,花椒窄吉丁OBPs和CSPs分别与苹果小吉丁A. mali的OBPs和CSPs氨基酸序列一致性最高。RPKM值表明,嗅觉相关基因AzanOBP1和AzanOBP2在雌成虫触角中不表达,在雄成虫触角中微量表达;AzanOBP3在雄成虫触角中高丰度表达。【结论】首次获得了花椒窄吉丁成虫触角转录组数据,筛选到了花椒窄吉丁OBP, CSP, Or, IR和SNMP等的嗅觉相关基因。推测触角中高丰度表达的OBPs对雄成虫识别同类异性释放的信息素或寄主植物释放的挥发物起关键作用。研究结果可为花椒窄吉丁化学感受基因功能分析及嗅觉感受机制研究奠定分子基础。     

花椒窄吉丁转录组及化学感受相关基因的分析

【目的】建立花椒窄吉丁 Agrilus zanthoxylumi 转录组数据库,挖掘其基因组数据。【方法】采用高通量测序平台Illumina NovaSeq6000对花椒窄吉丁成虫不同组织(触角、头、胸、腹、足、翅)进行转录组测序、序列组装,使用BLAST软件将花椒窄吉丁unigenes序列与公共数据库进行比对,BLAST同源性搜索的方法从中筛选出与其化学感受相关的基因,并与其他已研究发表的鞘翅目昆虫化学感受相关基因的核酸序列比对,进行系统发育分析。利用RPKM值对这些基因在花椒窄吉丁成虫不同组织中的表达量进行分析。【结果】经测序及序列拼接后共得到80 320条unigenes和 169 398 条contigs,其G+C比例分别是37.63%和39.18%,平均长度分别为828.75和1 084.33 bp;unigenes长度主要分布在200~400 bp的共有37 374条,占全部unigenes的46.53%。在NR数据库中注释的与花椒窄吉丁转录组相似基因所属物种分布为赤拟谷盗 Tribolium castaneum 所占比例26.80%,其后依次是小家鼠 Mus musculus (13.87%),蛀犀金龟 Oryctes borbonicus (5.26%),山松甲虫 Dendroctonus ponderosae (4.10%),黑蚁 Lasius niger (2.36%),其他物种所占比例是47.61%。在GO数据库中比对到27 488个unigenes,可分为分子功能、细胞组分和生物学进程三大类共59个过程;利用KOG数据库功能注释分为25类,注释到unigenes 最多功能类别的是普通功能,共 4 666个,最少的是与细胞移动相关,共40个;将80 320个unigenes映射到KEGG数据库中,21 104条unigens注释到代谢通路35个,占26.27%,注释最多的代谢途径是转录途径,共涉及到2 037条unigenes。从NR数据库中共注释到8个气味受体(odorant receptor, OR)基因、7个离子型受体(ionotropic receptor, IR)基因和6个味觉受体(gustatory receptor, GR)基因,各组织中的基因表达量分析发现,这3类化学感受相关基因在成虫触角中的表达量显著高于其他组织中的表达量,雌、雄触角中表达量差异最显著的为 AzanOR 1,而在雌、雄成虫足中这3类化学感受相关基因表达量没有差异。【结论】本研究首次获得了花椒窄吉丁转录组数据,为进一步研究花椒窄吉丁的基因功能奠定了分子基础。     

花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的克隆、原核表达及组织表达谱分析

【目的】本研究克隆花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因AzanOBP3,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解OBP基因在花椒窄吉丁成虫触角识别气味物质过程中的作用,为农林害虫的绿色防控提供理论依据。【方法】利用RT-PCR扩增花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的cDNA序列,采用生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列;构建重组表达载体pET-28a(+)/AzanOBP3,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中进行融合蛋白的IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;基于qPCR技术分析AzanOBP3基因在花椒窄吉丁雌雄成虫不同组织(头、胸、腹、足和翅)中的表达情况。【结果】克隆获得了花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的cDNA全长序列(GenBank登录号:MT318832),预测到其开放阅读框长414 bp,共编码137个氨基酸,等电点为4.79,蛋白分子量为16.038 kD,N末端具有29个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列中具有6个保守的半胱氨酸残基,属于典型的昆虫OBP。序列分析表明,AzanOBP3的氨基酸序列分别与苹果小吉丁Agrilus mali AmalOBP2和白蜡窄吉丁Agrilus planipennis AplaGOBP的一致性最高,分别为74.45%和76.92%,在进化关系上更加同源。构建了重组表达载体pET-28a(+)/AzanOBP3。在37℃180 r/min摇床培养及1 mmol/L IPTG诱导4 h条件下,AzanOBP3在大肠杆菌中成功地表达出了与预测蛋白分子质量大小一致的AzanOBP3融合蛋白。qPCR检测结果表明,AzanOBP3基因在雌性和雄性成虫的不同组织中都有表达,其中在雄成虫足中的表达量最高。【结论】明确了AzanOBP3的核苷酸和氨基酸序列组成及编码蛋白的理化特性。组织表达谱结果提示, AzanOBP3的功能可能不仅局限于嗅觉识别,在非嗅觉器官中可能也具有重要的生理功能,特别是在其寻找寄主植物与取食的过程中可能发挥着重要作用,AzanOBP3功能还需更深入的研究。本研究为今后更深入地探究气味结合蛋白的结构及其在花椒窄吉丁化学感受系统中的作用机制提供依据。