Grp78/Bip介导戊型肝炎病毒衣壳蛋白对宿主细胞的吸附

目的 探讨Grp78/Bip在戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白进入宿主细胞过程中的作用。方法 采用pull-down和免疫共沉淀技术进一步验证p239与Grp78/Bip的相互作用;采用激光共聚焦显微镜技术检测p239与细胞膜表面Grp78/Bip共定位情况;采用原核表达纯化的Grp78/Bip蛋白封闭p239的Grp78/Bip结合位点,检测其阻断p239吸附细胞的效果。结果 p239与Grp78/Bip可以直接结合,而且这种结合是可逆的生理性结合;p239与Grp78/Bip在细胞膜上存在部分共定位;Grp78/Bip能部分阻断p239对肝细胞的吸附。结论 Grp78/Bip参与并介导HEV衣壳蛋白对宿主细胞的吸附。Objective To further investigate the interaction between recombinant hepatitis E virus (HEV) capsid protein p239 and Grp78/Bip and the role of Grp78/Bip in HEV penetration.Methods We utilized pull-down, immunoprecipitation and antibody blocking assays to examine the interaction between p239 and Grp78/Bip. Confocal microscopy was used to investigate the co-localization of these two proteins. Purified Grp78/Bip was used to block the attachment of p239 to host cells.Results p239 directly bound to Grp78/Bip and this binding was sensitive to ATP. Furthermore, antibody blocking results demonstrate that this interaction was indeed conformation-dependent. A partial co-localization of p239 and Grp/Bip was observed on the plasma membrane of HepG2 by confocal microscopy. Pre-incubation of Grp78/Bip with p239 significantly blocked the attachment of p239 to HepG2 cells.Conclusion Grp78/Bip participates in the attachment and/or entry of the HEV capsid protein to host cells. These results further contribute to the understanding of the entry mechanism of the hepatitis E virus after infection. if(document.getElementById('ChDivSummary').innerHTML!="){CutSpan('ChDivSummary',500);DisplaySpanDiv('ChDivSummary');ClearSummaryOnLoad('SummaryLinkChID','SummaryLinkEnID');}else{CutSpan('EnDivSummary',1000);DisplaySpanDiv('EnDivSummary');ClearSummaryOnLoad('SummaryLinkEnID','SummaryLinkChID');}     

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性T淋巴细胞方法的探讨

用绿色荧光前体化合物Calcein AM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应.通过对一系列标记条件的研究:不同浓度Calcein AM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定CalceinAM荧光素标记法的最佳条件.用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb/c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E/T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65%.通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性.     

HepG2细胞中与戊型肝炎病毒衣壳蛋白相互作用蛋白的初步研究

利用重组戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白片段p239(368~606 aa)形成的类病毒颗粒作为亲和层析诱饵蛋白,HepG2为细胞模型,筛选与p239类病毒颗粒特异性相互作用蛋白。经过二维电泳分离,MALDI-TOF-MS分析鉴定得到GRP78/Bip,HSP90,alpha-tubulin及P43四个与p239有相互作用的候选蛋白。GRP78/Bip为热休克蛋白家族成员,体外免疫共沉淀实验结果证实,其与p239有特异性的结合。此研究结果为深入研究HEV的感染过程如吸附、入胞,以及HEV的致病机理提供了有益线索。     

人肝细胞内戊型肝炎病毒结合蛋白的酵母双杂交筛选

为进一步深入研究戊型肝炎病毒(HEV)感染机制以及致病机理,用酵母双杂交系统从人肝细胞cDNA文库中筛选与戊型肝炎病毒衣壳蛋白E2相互作用的蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,4个克隆与E2相互作用,其中一个克隆与P38IP高度同源,细胞免疫共沉淀实验结果显示:在哺乳动物细胞水平仍能够检测到E2与P38IP片段的特异的相互作用。     

戊型肝炎病毒重组颗粒性蛋白疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答研究

HEV 239是福建省医学分子病毒学研究中心实验室研制的一种戊型肝炎病毒（HEV）重组颗粒性蛋白疫苗,该文旨在研究HEV239蛋白疫苗在小鼠体内诱导产生特异性免疫应答的情况.将5μg HEV 239蛋白疫苗（239-Pro）、加铝佐剂疫苗（239-Vac）或加弗氏佐剂疫苗（239-CFA）肌肉注射免疫BALB/c鼠3次,第8周检测鼠血清抗HEV抗体及其亚类,同时用ELISPOT方法检测细胞毒性T细胞（CTL）应答.结果显示：239-Vac诱导的抗体滴度与239-CFA相当,高于无佐剂的239-Pro.239-Vac诱导的抗体中,IgG1/IgG2a比值显著高于239-CFA和239-Pro,主要为Th2型应答.除239-CFA之外,239-Vac和239-Pro也可诱导出一定的HEV抗原特异性I型Tc应答.提示：重组抗原HEV 239能诱导良好的抗体应答及一定的Tc1应答.     

肠道病毒68型新型中和试验方法的建立及其初步应用

针对肠道病毒68型(EV-D68)建立一种新型快速、高效的中和试验方法,并初步评价其在EV-D68流行病学研究中的应用价值。以灭活EV-D68病毒免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术制备其单克隆抗体;筛选反应性好、特异性强的抗EV-D68单克隆抗体作为检测抗体,基于酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)建立EV-D68高效中和试验方法;进一步比较该方法与传统中和试验方法 Nt-CPE的一致性,并使用该方法对临床血清样本进行检测。共获得10株分泌抗EV-D68单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取一株性能最优的15C5进行生产纯化,鉴定其为IgG3亚型;以15C5为检测抗体,建立了快速检测EV-D68中和抗体的Nt-ELISPOT方法;与Nt-CPE方法比较,Nt-ELISPOT方法将检测时间由5~7d缩短至1d以内,并且两种方法检测结果一致性良好;应用所建立的Nt-ELISPOT方法对厦门地区146份人群血清样本进行检测,显示血清样本EV-D68中和抗体阳性率为98.6%(144/146),提示厦门地区可能存在过EV-D68的流行。本研究基于ELISPOT建立的新型EV-D68中和试验方法快速可靠,适合通量检测,可以应用于EV-D68中和抗体水平的血清学调查,为EV-D68感染的防控工作提供帮助。     

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性T淋巴细胞方法的探讨

用绿色荧光前体化合物Calcein AM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应。通过对一系列标记条件的研究：不同浓度Calcein AM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定Calcein AM荧光素标记法的最佳条件。用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb／c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E／T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65％。通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性。     

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白p239特异性吸附、侵入HepG2细胞并阻断野病毒对肝细胞的感染

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的戊型肝炎在临床症状上与甲肝相似,但病死率更高,妊娠晚期病死率可高达15%～25%[1].近年来,戊肝在世界各地暴发不断;而我国戊肝发病迅速增长,已经成为普遍流行、危害严重的疾病之一[2].     

戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究

E.coli中表达的HEV衣壳蛋白片段P239(aa368~606)形成的类病毒颗粒与戊肝患者恢复期血清及中和单抗具有良好的反应性,较好地模拟了天然HEV病毒颗粒的表面空间结构。利用P239吸附HepG2细胞的模型来模拟HEV对宿主细胞的吸附,多株中和单抗对吸附的阻断验证了吸附的特异性。P239与多株传代细胞系的吸附结果则表明了这种特异性吸附的细胞选择性。对阻断P239吸附的线性单抗进行定位,初步确定了P239与细胞相互作用的区域:ORF2上的aa423~443很可能和病毒上的细胞膜受体结合部位非常靠近,或可能直接参与构成了病毒与细胞特异性识别的表位。此本研究为进一步研究HEV与宿主细胞的相互作用提供一定的线索。     

戊型肝炎病毒衣壳蛋白结合CYP 2A6并降低其底物催化能力

肝炎病毒的感染常常导致人体肝脏代谢能力变化,研究表明甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus,HAV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)的感染都会影响肝细胞对药物的代谢能力。在本研究中,通过酵母双杂交系统在人肝cDNA文库中筛选与戊型肝炎病毒重组衣壳蛋白E2结合的蛋白,发现了与细胞色素P450 2A6(CYP2A6)部分片段高度同源的蛋白序列。通过pull-down、免疫共沉淀以及特异性底物催化反应评价等方法进一步证实了CYP2A6与重组衣壳蛋白E2、p239间的相互作用,并发现与p239结合可以降低CYP2A6对其特异性底物香豆素的催化能力。上述结果提示CYP2A6可能在戊肝病毒入侵细胞后的细胞病变过程中起作用。