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旨在研究肠上皮细胞(IEC-6)RNA干扰效率的特染条件,并对4对Hsp70干抚序列进行筛选,为进一步以RNA干扰(RNAi)技术研究Hsp70对胃肠道的保护功能以及介导信号通路的机理打下基础.以24孔培养板培养IEC-6细胞,利用阳高子脂质体特染FAM-siRNA片段进入IEC-6细胞,采用荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测FAM-siRNA和特染试剂Lipofectamine 2000不同剂量比例对特染效率的影响,并进一步采用RT-PCR和Western blotting方法对Hsp70干扰序列进行筛选.试验结果表明,采用脂质体转染法可获得较高的转染效率,其中以80 nmol/L FAM-siRNA+1μL Lipofectamine 2000组的转染效率最高(85.77％).针对4个不同靶位点,进行Hsp70基因干涉,结果表明,4个组中Hsp70 mRNA的表达显著下降,其中oligo 4组的基因表达极显著降低.Western blotting的结果表明,oligo 2、oligo3和oligo4组中的Hap70蛋白表达极显著降低.最终确定80 nmol/L FAM-siRNA+1μL Lipofectamine 2000为最佳转染条件,以oligo 4(Hap70的基因位点为3672 -3692)为最佳RNA干扰靶基因. 相似文献
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