两栖动物酒精标本DNA模板的快速提取

本文以中国角蟾属4个种的蝌蚪酒精固定标本为材料,取尾部肌肉组织0．1g,滤纸吸干组织块表面的酒精,在研钵中用剪刀剪碎,液氮研磨成粉(必要时可加少量石英砂),转入1．5ml离心管,加入1．0ml提取缓冲液(0．5％SDS,10mmol/L Tris-HCl,100mmol/L EDTA,pH8.0),37℃温浴h,5000r/min离心10min,取上清转入另一1.5ml离心管,氯仿/异戊醇(24：1)抽提两次,上清液加2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇沉淀DNA,12000r/min离心3min,无菌条件下风干后,50μl TE溶解,4℃保存备用。以通用引物PCR扩增12S rRNA和16S rRNA基因部分片段并测序。本文不采用蛋白酶K提取酒精保存标本的DNA模板,全部流程只需3个小时,可同时提取数十个乃至数百个标本,并且所提取的DNA模板适合短片段PCR扩增。     

基于16S rRNA序列的角蟾科部分属间系统关系

采用最大似然法(ML法)、最大简约法(MP法)、邻接法(NJ法)对来自角蟾科Megophryidae(Anura)8属17种及外群2种共25条400bp左右的线粒体16S rRNA序列进行系统发育关系分析。结果表明,用于分析的所有角蟾科物种形成两大支,第一支包括Megophrys,Brachytarsophrys和Atympanophrys,第二支包括Leptobrachium,Leptolalax,Scutiger,Oreolalax和Vibrissaphora。支持将角蟾科划分为两大类群,即第一支属于Megophryini族．第二支属于Leptobrachiini族。根据分子钟模型初步推测两类群问的分歧时间大致为14．2～18．7百万年前。在Megophryini族中,基因树的拓扑结构不支持Atympanophrys建立后的Megophrys为单系;而在Leptobrachiini族中,Leptolalax为一有效属,其系统发生较早。