橡胶树胞质型谷胱甘肽还原酶基因的克隆与表达分析

根据橡胶树GR1基因（Hb GR1）部分序列设计特异引物,运用RACE和RT-PCR技术克隆Hb GR1全长c DNA序列;运用DNAMAN、MEGA 6.06、Prot Param及Signal P 4.1 Server等生物信息学软件对Hb GR1序列、GR1系统进化关系及Hb GR1的基本理化性质和亚细胞定位等进行分析;利用实时荧光定量PCR技术研究Hb GR1的表达模式;构建原核表达载体p EASYE1-Hb GR1,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导融合蛋白原核表达。获得2 082 bp的Hb GR1全长c DNA,其中5′非编码区293 bp,3′非编码区298 bp,开放阅读框长1 491 bp,共编码496个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为53.68 k Da,理论等电点p I为6.18。序列分析发现Hb GR1无信号肽,在氨基酸水平上与其他植物GR1具有很高的同源性,包含植物GR典型的NADH结合结构域、二聚体结构域和高度保守的GGTCV[I/L]RGCVPKK[I/L]LVY基序。对植物GR进行系统进化分析表明,Hb GR1属于双子叶植物GR分枝,与同属大戟科的蓖麻亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明Hb GR1在橡胶树胶乳、叶片、树皮和花中均表达;Hb GR1表达受死皮、乙烯、茉莉酸、过氧化氢和伤害调控。SDS-PAGE电泳结果表明重组质粒p EASY-E1-Hb GR1在大肠杆菌BL21（DE3）中有效表达一个分子量约为55 k Da的融合蛋白。     

海南生态区植物根际解磷细菌的筛选及分子鉴定

【目的】了解海南酸性土壤解磷细菌溶解Ca3(PO4)2和FePO4特性;筛选高效稳定的解磷菌株,为应用研究提供菌源。【方法】采集海南21种植物的根际土样品,用营养琼脂、结晶紫-营养琼脂、酵母粉-甘露醇琼脂,稀释涂布法分离土壤细菌,选取平板上菌落形态有明显区别的代表性菌落,用最低营养琼脂进行纯化;Ⅰ筛用Ca3(PO4)2固体培养基培养5 d,挑取有溶磷圈的菌落;Ⅱ筛用Ca3(PO4)2培养液在32℃、200 r/min条件培养6 d,挑取解磷量大于200 mg/L的菌株;Ⅲ筛是在4次继代培养及每次15 d的4℃保藏后,用Ca3(PO4)2培养液培养6 d,挑取解磷量大于200 mg /L的菌株。称Ⅲ筛的选出菌株为高效稳定的解磷细菌(PSBHS),用FePO4培养液对PSBHS培养6 d,并测定解磷量;用简并引物扩增PSBHS 16S rDNA基因一个长度约1460 bp的片段,测序后,通过Blast检索同源序列,鉴定解磷细菌分类。【结果】共分离到363个代表性菌株,通过Ⅰ筛、Ⅱ筛、Ⅲ筛的代表性菌株分别是126个、45个、14个;14个PSBHS在Ca3(PO4)2培养液中经6 d培养,解磷量达201.0 mg/L ~623.3 mg/L,培养结束时pH值(3.82~4.34)与解磷量呈极显著负相关（r = -0.8155)。14个PSBHS在FePO4培养液中经6 d培养,解磷量只有1.6 mg/L ~34.2 mg/L,培养结束时pH值(2.87~5.67)与解磷量也呈极显著负相关(r = -0.6836)。16S rDNA序列分析,确定了6个PSBHS为Acinetobacter, 3个为Pseudomonas, 3个为Serratia, 2个为Enterobacter。     

红树林土壤细菌群落16S rDNA V3片段PCR产物的DGGE分析

从土壤中抽提微生物总DNA ,直接扩增 16SrDNAV3片段 ,应用变性梯度凝胶电泳 (DGGE)和分子克隆技术分析 16SrDNAV3片段的多态性 ,发现地域因素和红树品种都是影响土壤细菌群落结构的因素。通过对杯萼海桑土壤 16SrDNAV3片段PCR产物两个DGGE条带进行分子克隆、序列测定和Blast分析 ,发现每个DGGE条带包含着许多不同的 16SrDNAV3片段 ,并且其中多数为NCBI未收录的序列。这表明DGGE和克隆技术相结合的方法是研究土壤微生物群落结构的一种可行方法。