人肿瘤坏死因子α基因穿梭表达载体的构建和在鱼腥藻7120中的表达

报道了人肿瘤坏死因子α(hTNFα)基因穿梭表达载体的构建及其在丝状体蓝藻鱼腥藻 712 0中的表达和鉴定结果 .将质粒pRL rhTNF上hTNFα的cDNA连于pRL 43 9质粒上的PpsbA启动子下游 ,得到中间载体pRL TC .进一步与穿梭质粒pDC 8重组 ,得到可在大肠杆菌和蓝藻中均可表达的穿梭表达载体pDC TNF .pRL rhTNF ,pRL TC和pDC TNF三者在大肠杆菌中的表达量分别为 11.8% ,16 9%和 15 .0 % .通过三亲接合转移将pDC TNF引入鱼腥藻 712 0中并获稳定遗传的转基因株 .从转基因的鱼腥藻 712 0中检测到pDC TNF质粒的存在 ,且在和TNFα的cDNA探针进行的Southern杂交中呈阳性反应 .抽提转基因藻的蛋白样品进行检测 ,在Western印迹中和TNFα单克隆抗体呈阳性反应 .采用TNF对L92 9细胞的细胞毒性方法 ,证明转基因藻粗提液中 ,TNF确有细胞毒活性 .     

Construction of shuttle, expression vector of human tumor necrosis factor alpha (hTNF-α) gene and its expression in a cyanobacterium, Anabaena sp. PCC 7120

The construction of the shuttle, expression vector of human tumor necrosis factor alpha (hTNF-a) gene and its expression in a cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 was reported. The 700-bp hTNF cDNA fragments have been recovered from plasmid pRL-rhTNF, then inserted downstream of the promoter PpsbA in the plasmid pRL439. The resultant intermediary plasmid pRL-TC has further been combined with the shuttle vector pDC-8 to get the shuttle, expression vector pDC-TNF. The expression of the rhTNF gene in Escherichia coli has been analyzed by SDS-PAGE and thin-layer scanning, and the results show that the expressed TNF protein with these two vectors is 16.9 percent (pRL-TC) and 15.0 percent (pDC-TNF) of the total proteins in the cells, respectively, while the expression level of TNF gene in plasmid pRL-rhTNF is only 11.8 percent. Combined with the participation of the conjugal and helper plasmids, pDC-TNF has been introduced into Anabaena sp PCC 7120 by triparental conjugative transfer, and the stable transgenic     

螺旋藻原生质球的分离及其光合作用特性的研究

利用改进后的分离方法可获得大量有活性的钝顶螺旋藻 ( Spirulina platensis)原生质球。原生质球大小不等 ,直径在 2 .9～ 4 .6μm,原生质球表面有皱纹及小的孔洞 ,放氧速率为完整藻的 4 0 %。原生质球的室温吸收光谱表明其色素种类与完整细胞基本相同 ,都具有叶绿素 a、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白和类胡萝卜素。但原生质球中减少了藻蓝蛋白和类胡萝卜素的相对含量 ,而藻红蓝蛋白明显增多。螺旋藻的完整细胞与原生质球的 77K荧光发射光谱略有不同 :激发光为 4 36nm时 ,藻丝体和原生质球都具有 4个荧光发射峰 :F686、F696、F730和 F75 7,原生质球的 F75 7明显减弱 ;激发光为 5 80 nm时 ,藻丝体有 5个发射峰 :F64 0、F685、F693、F72 8和 F75 8,原生质球的 F75 8消失。原生球中 F72 8/F685、F64 0 /F685值增高 ,F693/F685值降低 ,光系统 的 F72 8与捕光色素系统的 F64 0的比值降低。上述结果表明 ,失去细胞壁可能抑制光系统 活性 ,在光系统 与 F695有关的核心天线色素系统受影响更大     

人肿瘤坏死因子-α基因对鱼腥藻7120的光合活性的影响

藻类分子生物学和基因工程的发展已使外源基因能在蓝藻中表达,这就有可能分析外源基因对光合作用的影响。本研究采用两种转化系统所得的转基因蓝藻(Anabaena sp.PCC7120)1(To1)、2(To2)及野生藻(Wo)测定其生长曲线表明,它们的生长速度比较接近,转基因藻略微缓慢,生物量也偏少。用氧电极测定转基因藻的饱和光强与野生藻接近,为480μEm~(-2)s~(-1),最大放氧量为355mol O_2/mg Chl.h.吸收光谱测定结果表明转基因藻与野生藻的色素组成一致,均含有叶绿素a、类胡萝卜素和藻蓝蛋白等,但T02的藻胆蛋白含量高于野生藻。低温荧光发射光谱测定表明,外源基因的导入及表达促进了转基因藻中藻蓝蛋白的合成,改变了光能在两个光系统之间的分配,特别是由藻胆蛋白吸收的光能向光系统Ⅰ的传递受阻,不同的转化系统中所得的转基因藻中表现程度亦有差异。