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通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+ )-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础.提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA.以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90ABl.将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经Nde I和Sal I双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆.挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+ )-hHsp90AB1.重组质粒转化Rosetta( DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13%.接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶素和层析,蛋白纯度达到98%. 相似文献
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[目的]核酸的甲基化修饰是一种常见的化学修饰形式,具有重要的生物学功能,却也在一定程度上给一些核酸研究过程带来了技术难度。tRNA上具有的大量甲基化修饰会阻碍逆转录进程,从而降低荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和高通量测序对其的检测效率。来自大肠杆菌(Escherichia coli)的AlkB蛋白是一种多功能的脱烷基化酶,可以去除DNA和RNA上多种甲基化为代表的修饰,有望解决以上问题。[方法]针对大肠杆菌来源的AlkB,分别尝试在大肠杆菌和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中进行诱导表达和纯化,对纯化获得的AlkB进行酶学性质测定。最后以tRNAUAUIle等两种tRNA为代表,研究AlkB的处理对于荧光定量PCR法检测tRNA表达水平的影响。[结果]AlkB在大肠杆菌中表达时多以包涵体形式存在,但是在毕赤酵母中可以成功分泌表达。使用镍柱分离纯化后获得了纯度高于95%的AlkB蛋白,其酶学性质参数如... 相似文献
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土壤活性有机碳是土壤有机碳(SOC)的活性部分,是衡量土壤质量和健康状况的重要指标,能够反映植被恢复演替过程中土壤环境的早期变化。但在SOC贫瘠的沙地,长期恢复演替如何影响土壤活性有机碳组分尚不清楚。本研究以毛乌素沙地杨柴人工灌木林为研究对象,分别选取未造林(CK)与造林年限9 a、18 a和30 a的杨柴人工灌木林,探究毛乌素沙地杨柴人工灌木林恢复演替过程中土壤可溶性有机碳(DOC)、微生物量碳(MBC)、易氧化有机碳(ROC)和SOC变化规律。结果表明:(1)毛乌素沙地杨柴灌木林随恢复演替年限增加土壤固碳能力增强,但在恢复演替18 a时出现转折点,恢复演替18—30 a时土壤固碳速率相对减缓;(2)表层0—10 cm土壤DOC、MBC和ROC对恢复演替响应较为敏感,恢复演替过程中表层土壤活性有机碳各组分含量逐渐升高;(3)恢复演替年限并未对土壤活性有机碳占SOC比例产生显著影响,同时也未显著改变碳库活度。综上所述,毛乌素沙地杨柴灌木林恢复演替有助于土壤活性有机碳和SOC积累,但长期恢复演替是否持续对土壤活性有机碳固持产生积极作用仍需进一步研究。 相似文献
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排水严重改变泥炭地的环境和生态过程,但对泥炭藓孢子萌发力的影响尚不清楚。在长白山地区白江河泥炭地,分别在优势植物为苔藓的近原始地段和优势植物为小灌木的排水地段,钻取泥炭柱芯为试验材料,逐层测试泥炭理化指标,提取泥炭藓孢子并进行萌发试验,统计孢子数量和萌发力;经过泥炭样品年代测定,建立深度年代关系曲线,研究泥炭藓孢子萌发力对排水的响应和机制。结果表明: 整个柱芯对比,近原始地段平均孢子数略高于排水地段,两地段的平均孢子萌发力无差异,排水地段的泥炭容重、总碳和总氮都显著高于近原始地段。柱芯上部对比,排水(1987年)以后两地段孢子累积速率无显著差异,但近原始地段的平均孢子萌发力(34%)远低于排水地段(72%)。近原始地段的碳氮比与孢子萌发力呈显著正相关;排水地段的总碳、pH和埋藏时间与孢子萌发力呈显著负相关。30年前的泥炭地排水虽对孢子累积影响不大,但通过加速分解而改变了泥炭的理化性质,提升了表层泥炭中孢子萌发力,因此降低孢子库的持久性,可能导致泥炭藓在灾变性干扰后的种群持续更新潜力下降。 相似文献
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【目的】构建蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ccp A缺失菌株,并初步探索ccp A基因对其碳代谢及氨肽酶生产的影响。【方法】利用温敏型质粒p KSV7构建蜡样芽胞杆菌CZ ccp A基因缺失突变株CZΔccp A,通过回补菌株对敲除株表型进行验证;不同碳源发酵对比菌株碳代谢的变化,进行氨肽酶发酵优化。【结果】成功构建ccp A缺失菌株CZΔccp A与回补菌株CZ1,三株菌在LB培养基中生长无差异;在柠檬酸钠以及甘露低聚糖为碳源时,菌株的代谢产生明显变化;以D-木糖为单一碳源时,氨肽酶的产量提高48.25%。【结论】CZ ccp A基因对柠檬酸钠、甘露低聚糖、D-木糖为单一碳源时的代谢可能具有调控作用,ccp A基因缺失可以提高蜡样芽胞杆菌CZ的氨肽酶产量。 相似文献
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微卫星DNA在吉戎兔亲子鉴定中的应用研究 总被引:16,自引:2,他引:14
选用Sat2、Sat3、Sat4、Sat5、Sat7、Sat8、Sat12、Sat13、Sat16、Sol08、Sol28、Sol30、Sol03 等13个微卫星位点PCR扩增30只吉戎兔的基因组DNA,然后在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分型,检测结果为平均等位基因数为3.46个,平均杂合度(H)为0.578,平均多态信息含量(PIC)为0.531,双亲资料未知时13个位点的累计非父排除率(PE1)为0.935226,置信度低于80%,一亲本资料已知时13个位点的累计非父排除率(PE2)为0.999329,置信度为95%。由于所鉴定兔群的母本资料已知,因此基因型的分型结果能有效确认18只仔兔子的真父。 相似文献
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目的建立用荧光定量PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.方法根据自己克隆的猪IGF-Ⅰ(GenBankNo.DQ784687)基因mRNA序列,设计合成引物和探针,采用Taqman探针荧光定量RT-PCR的检测方法,构建检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.结果由pMD-18TIGF-Ⅰ所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102~1×106拷贝猪IGF-Ⅰ基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠.结论成功构建了用荧光定量RT-PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线. 相似文献
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叶面积指数(LAI)的田间测量是生态和农业等领域的常规工作之一,测量方法分为直接测量和间接测量,间接测量中有一类方法基于数字相机照片提取冠层孔隙率,再用有限长度平均法同时估算LAI和聚集指数。然而,有限长度平均法自提出以来缺少进一步的发展,在有限长度的样线/样方上应用比尔定律的方式具有理论缺陷,可能造成无效值或高估LAI。从模拟的训练数据中提取经验公式以取代比尔定律进行样线/样方的LAI估算,提高了有限长度平均法的精度和鲁棒性。进一步分析在一定精度需求下对样线/样方大小和数量的要求,对于非均匀样地,提出样线长度为8倍等效叶片边长、样方边长为3倍等效叶片边长的推荐设置。在基于数字相机照片提取非均匀样地LAI的应用中,使用样方采样比样线采样更为适宜。 相似文献