谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统的优化

作为新型的基因组编辑工具,碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的定位功能和碱基脱氨酶的编辑功能,可实现特定位点的碱基突变,具有不产生双链DNA断裂,无需外源模板且不依赖染色体DNA同源重组的优势。目前,研究者们已在重要的工业生产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中开发了多种碱基编辑工具,并实现了两基因和三基因的同时编辑。文中针对谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统中存在的不足(多重sgRNA结构烦琐、重复序列干扰、更换靶点困难等),采用多种策略进行优化,并比较碱基编辑效率:首先优化基于单独启动子/终止子的多重sgRNA表达框,通过构建框架质粒,并结合Golden Gate连接方法,加速靶点更换,避免重复序列干扰,虽然该方法 sgRNA结构烦琐,但编辑效率最高;同时,开发基于Type ⅡCRISPR crRNA阵列、tRNA加工的多重gRNA表达框,这两种形式均只需要一个启动子和一个终止子序列,极大地简化了表达框结构,虽然编辑效率均出现下降,但仍具有一定的实用性。该研究丰富了谷氨酸棒杆菌的基因组编辑工具,为该菌株的遗传改...     

红纹黄单胞菌a-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高

【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。     

产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76的固定化

用在有机溶剂中成型的琼脂凝胶包埋,结合戊二醛处理的方法,制备产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76固定化细胞,其细胞含量可达50%以上。固定化细胞水解青霉素 G 钾盐的最适 pH 为8.0,比原细胞约高0.3pH 单位;最适温度与原细胞一样,均为45℃。固定化后,Hg2+对酶抑制作用降低,但酶对Fe3+、Cu2+等金属离子敏感性增加。在无底物情况下,与原细胞相比,固定化细胞对 pH 和热的稳定性增加;4℃保存14个月无活力损失。固定化细胞装柱,在pH7.7,37℃下连续裂解青霉素 G,转化率达95%以上。155天无明显酶活力损失。     

穗花杉染色体的研究

穗花杉为国家三级重点保护的珍稀濒危植物,雌雄异株。根尖细胞染色体分析表明：雌株和雄株的染色体数目为２ｎ＝４０,其中第１对和第２对为中部着丝粒染色体,第３－２０对为端部着丝粒染色体。核型为２ｎ＝４０＝４ｍ＋３６Ｔ。雌雄株除第２对的长度稍有差异外,其余各对的相对长度和臂比都较近似,可能尚无性染色体分化。Ｇｉｅｍｓａ Ｃ带显示,间期核有３个较大的染色中心,最长的３条染色体的中央缢痕有深染色带纹,可能是着     

黄河上游甘蒙柽柳生长对极端旱涝的响应

青藏高原黄河上游河岸带是典型的生态脆弱区, 然而近年来气候变暖加剧了该地极端旱涝事件的频繁发生, 高原河岸带生态脆弱区植被是否能够应对极端旱涝事件的干扰成为流域生态环境管理工作所关注的重点问题。为了研究黄河上游河岸林中主要树种对极端旱涝的响应, 该研究选取青海省同德县和兴海县3处河岸林中的47株甘蒙柽柳(Tamarix austromongolica), 分别从树干面向邻近山体一侧及与之垂直的一侧分别获取1根树轮样本, 分析其历史生长。通过对比两个方向上的生长速率判断甘蒙柽柳是否受到地质灾害影响从而将其划分为受伤组和对照组, 分析两组甘蒙柽柳在过去63年中径流极值年的抵抗力状况及两个方向的生长差异。研究发现, 甘蒙柽柳对干旱和洪涝均有着很强的抵抗力, 河岸带多样化的水分来源有助于甘蒙柽柳在极端干旱环境中较好地生长; 但洪涝伴随泥石流等地质灾害的频发使甘蒙柽柳面向山体侧面受到严重的生长抑制, 表现出显著的方向性差异, 从而影响甘蒙柽柳的形态。较长的创伤恢复期带来的遗留效应可能造成甘蒙柽柳对外界干扰的较高敏感性。研究黄河上游甘蒙柽柳生长对极端旱涝的响应, 将有助于评估生态脆弱区生态弹性过程, 同时为高原河岸带生态建设和恢复提供科学依据。     

全细胞高通量筛选α-氨基酸酯水解酶突变体的方法

【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的α-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线。采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定α-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与△A340?405在(0.1?0.6)×10?3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系,服从朗伯-比尔定律,平均回收率为99.8%?101.3%。一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选,获得3株kcat提高40%以上,4株半失活温度较野生型提高5°C以上的突变体酶。【结论】该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应,达到高通量筛选的要求。     

全细胞高通量筛选a-氨基酸酯水解酶突变体的方法

【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的a-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线。采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定a-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与△A340?405在0.1?0.6×10?3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系, 服从朗伯-比尔定律, 平均回收率为99.8%?101.3％。一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选, 获得3株kcat提高40%以上, 4株半失活温度较野生型提高5 °C以上的突变体酶。【结论】该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应, 达到高通量筛选要求。     

青霉素酰化酶产生菌的筛选和大肠杆菌AS 1.76产酶条件的研究

为筛选较优的产青霉素酰化酶的菌种,我们从9个属的232株纽菌中选出了19株产青霉素酰化酶的大肠杆菌,其中,AS 1．76和E 110为最好。还对大肠杆菌AS 1.76的产酶条件进行了研究。结果表明,最适的培养基成分是(％)：蛋白胨l,苯乙酸0．2,玉米浆0．3,氯化钠0．5;在250毫升的三角瓶中装30毫升培养基时,通气量正合适：培养基的初始pH以7.0为佳;培养时间15小时。在未加玉米浆的培养基中,少量的Fe2+(5馓克／毫升)对酶形成有刺激作用,过量的Fe2+(大于10教克／毫升)是不利的;在培养基中添加0．3％的玉米浆能降低Fe2+对酶形成毒害作用。     

分子串联重复策略用于制备超短肽

超短肽具有更好的稳定性、组织渗透性、生物相容性以及更低的免疫原性。GHK(glycyl-l-histidyl-l-lysine)和GQPR(glycyl-l-glutamyl-l-prolyl-l-arginine)具有刺激胶原蛋白产生、减缓胶原蛋白降解的作用,作为抗皱成分广泛应用于化妆品。超短肽一般都是通过固相合成方法制备,其缺陷是制备过程中大量使用有机化学试剂而造成环境负担,故本文探讨了一种设计和制备超短肽的新方法。因序列短而无法直接重组表达,文中首先构建了适用于融合表达的载体骨架pET28a-Trxm。以GHK和GQPR串联重复基因作为滚环扩增的基本单元(tandem repeat of short peptides,TRSP),反应时随机掺入5-甲基胞嘧啶获得长基因片段,然后经Acc65 Ⅰ和Apa Ⅰ消化产生随机长度的基因。胶回收500 bp到1500bp的DNA片段,克隆得到表达载体pET28a-Trxm-(TRSP)_n并转化获得重组菌。双酶切及测序结果表明,成功构建获得串联重复数n=1、2、3、4、6、7、8、9的阳性克隆。蛋白表达结果显示,当串联重复数n=1、2、3、4、8、9时均有相应融合蛋白表达,表达水平随着重复数增加而降低。Trxm-(TRSP)₁表达水平最高,达总蛋白的50%,而Trxm-(TRSP)₂表达水平为总蛋白的30%。进一步地,含Trxm-(TRSP)₁的清液先后经肠激酶和胰蛋白酶切割后,HPLC分析结果表明,成功获得超短肽GHK和GQPR。该结果对于超短肽重组制备的工业化应用具有重要价值。     

山西忻州地区1900-2012年典型森林的健康历史

健康的森林对维持其区域生态系统服务起着至关重要的作用,了解树木的生长历史对评估气候变化背景下森林的健康状况具有促进作用。选择山西高原中北部忻州地区保存较好的4个森林为研究对象,利用树木年轮学方法分析其生长变化特征,获得了该地区森林健康的时间和空间特征。结果表明：该地区森林在过去1个世纪中,存在3次不健康事件（1910-1940、1970-1987和1990-2012年）且在空间上表现出明显的同步性,不同时期的不健康事件持续时间和强度不尽相同,1930s的不健康事件持续时间最长也最为显着。树木径向生长与气象观测资料的相关分析显示,该地区森林生长主要与当年5-6月份温度呈负相关,与7月份降水和5-9月PDSI指数显着正相关。生长季持续的高温或降水减少造成的极端干旱事件是不健康事件空间一致性的主要驱动力,各采样点树种以及林分组成差异是影响时间特征不一致的可能原因。研究结果提供的森林健康历史数据对评估极端气候条件对森林健康生长的影响及制定合理的森林保护措施具有积极的现实意义。