Asia-Ⅰ口蹄疫病毒P1-2A基因真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

目的 构建含有Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A 基因的真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A，并用pVAXⅠ-P1-2A免疫小鼠，评价其体液免疫和细胞免疫水平。方法 通过RT-PCR 方法扩增得到含有FMDV P1-2A编码区的目的基因，并将其克隆到pMD18-T载体上。将pMD18-T-P1-2A和 pVAXⅠ分别经EcoRⅤ和XbaⅠ双酶切后连接构建真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A。将酶切鉴定正确后的重组质粒转染HeLa细胞进行IFA检测。再进行小鼠血清特异性抗体试验、小鼠T淋巴细胞增殖试验和IFN-γ ELISPOT试验。结果 酶切结果与预期目的条带大小相符；荧光结果表明经pVAXⅠ-P1-2A转染的细胞有明显的黄绿色荧光，说明P1-2A基因在HeLa细胞中得到了表达；小鼠免疫结果表明，用免疫的小鼠都产生了较强的体液免疫和细胞免疫，并且T淋巴细胞增殖数和产生IFN-γ的细胞数和对照组相比显著提高(P<0.05)。间接ELISA试验表明，在免疫第14天抗体水平比对照组明显增高(P<0.05)。结论 成功构建了真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并通过小鼠免疫试验发现重组质粒试验组能够诱导产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。     

盘羊肺炎支原体感染PCR检测方法的建立与初步应用

羊支原体性肺炎,是由支原体引起的一类高度接触性传染病,又称羊传染性胸膜肺炎(Infections pleuropneumonia of sheep and goats),临床症状主要表现为高热、咳嗽、消瘦、     

β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

为检测本课题组构建的枯草芽孢杆菌分泌表达载体pGPST中启动子和信号肽的活性，将β-半乳糖苷酶基因插入表达载体的多克隆位点，构建含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pGPST-lacZ，重组质粒转化枯草芽孢杆菌，分别测定液体培养基中上清液和菌体沉淀中β-半乳糖苷酶的活性。培养上清液中的酶活在22h达到峰值，约为26mU/mL，之后开始下降；菌体沉淀中的酶活在14h最高，达6mU/mL，而阴性对照pGPST没有检测到酶活性。结果表明分泌型表达载体中的启动子和信号肽具有较好的活性，能实现异源基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。本试验为该表达载体的进一步研究和应用提供重要的数据资料，也为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供参考资料。该载体将在研究外源基因在枯草芽孢杆菌中表达发挥重要作用。     

Asia-I口蹄疫病毒P1-2A基因真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

目的:构建含有Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A 基因的真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并用pVAXⅠ-P1-2A免疫小鼠,评价其体液免疫和细胞免疫水平.方法:通过RT-PCR 方法扩增得到含有FMDV P1-2A编码区的目的基因,并将其克隆到pMD18-T载体上.将pMD18-T-P1-2A和 pVAXⅠ分别经EcoRⅤ和XbaⅠ双酶切后连接构建真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A.将酶切鉴定正确后的重组质粒转染HeLa细胞进行IFA检测.再进行小鼠血清特异性抗体试验、小鼠T淋巴细胞增殖试验和IFN-γ ELISPOT试验.结果:酶切结果与预期目的条带大小相符;荧光结果表明经pVAXⅠ-P1-2A转染的细胞有明显的黄绿色荧光,说明P1-2A基因在HeLa细胞中得到了表达;小鼠免疫结果表明,免疫的小鼠都产生了较强的体液免疫和细胞免疫,并且T淋巴细胞增殖数和产生IFN-γ的细胞数和对照组相比显著提高(P<0.05).间接ELISA试验表明,在免疫第14天抗体水平比对照组明显增高(P<0.05).结论:成功构建了真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并通过小鼠免疫试验发现重组质粒试验组能够诱导产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答.     

高寒山区混播草地燕麦和毛苕子种间的竞争关系

植物通过调整生长发育阶段的生长行为和形态特征来适应种间竞争关系的变化.在祁连山区建立了禾本科牧草燕麦与豆科毛苕子混播草地,以相对产量(RY)、相对密度(RD)和相对产量总值(RYT)为指标,研究了这2种1年生植物在不同物候期的种间竞争关系.结果表明:随着物候期的变化,种间竞争关系发生着动态变化,在出苗期,二者存在激烈的种间竞争,2个物种限制彼此相对数量的发展,株高、叶片数等增长缓慢;分蘖期,种间竞争转换为种间协作,分蘖数、叶片数等迅速增大,相对产量总值不断积累;进入拔节期,毛苕子开始扩大相对数量,限制了燕麦的生长,导致了激烈的种内竞争;到结实期,种内竞争再次转化为种间竞争.不同物候期的燕麦和毛苕子通过对植物形态可塑性的调整,更好地响应了种间竞争关系的转换.     

一株裂解性奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

【目的】从新疆石河子地区奶牛粪样中分离裂解性大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage),对其进行纯化及生物学特性分析。【方法】利用双层平板法从奶牛粪样中分离、纯化噬菌体,将纯化后的噬菌体浓缩液用醋酸双氧铀负染后通过透射电子显微镜观察其形态特征。对该噬菌体进行全基因组测序和遗传进化分析,同时测定噬菌体的宿主谱、最佳感染复数、一步生长曲线、热稳定性及酸碱稳定性。【结果】分离并纯化出一株裂解性噬菌体vB_EcoM_XJ2,噬菌斑圆形不透明,直径0.7 mm–1.2 mm;电镜显示其头部呈正多面体对称,有可伸缩性尾部;核酸类型为双链DNA,基因组大小为75.617 kb,G+C%含量为42.09%;其核酸序列与大肠杆菌噬菌体NJ01和vB_EcoP_SU10相似性高达94%。生物学特性研究显示该噬菌体能裂解多株临床分离的大肠杆菌;能耐受60°C左右高温,在pH 5.0–11.0范围内效价稳定;最佳感染复数为0.1,潜伏期为15 min,暴发期为95 min,裂解量约为10.6 PFU/cell。【结论】vB_EcoM_XJ2是一株在不同温度、不同酸碱性环境中有较强适应能力的裂解性肌尾科大肠杆菌噬菌体。     

Asia-Ⅰ口蹄疫病毒P1-2A基因真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验术

目的：构建含有Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1-2A基因的真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A，并用pVAXⅠ-P1-2A免疫小鼠，评价其体液免疫和细胞免疫水平。方法：通过RT-PCR方法扩增得到含有FMDV P1-2A编码区的目的基因，并将其克隆到pMD18-T载体上。将pMD18-T-P1-2A和pVAXⅠ分别经EcoRⅤ和XbaⅠ双酶切后连接构建真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A。将酶切鉴定正确后的重组质粒转染HeLa细胞进行IFA检测。再进行小鼠血清特异性抗体试验、小鼠T淋巴细胞增殖试验和IFN-γ ELISPOT试验。结果：酶切结果与预期目的条带大小相符；荧光结果表明经pVAXⅠ-P1-2A转染的细胞有明显的黄绿色荧光，说明P1-2A基因在HeLa细胞中得到了表达；小鼠免疫结果表明，免疫的小鼠都产生了较强的体液免疫和细胞免疫，并且T淋巴细胞增殖数和产生IFN-γ的细胞数和对照组相比显著提高（P〈0．05）。间接ELISA试验表明，在免疫第14天抗体水平比对照组明显增高（P〈0．05）。结论：成功构建了真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A，并通过小鼠免疫试验发现重组质粒试验组能够诱导产生特异性的体液免疫和细胞免疾应答。     

猪源戊型肝炎病毒基因IV型ORF3编码蛋白的表达及鉴定

通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF3全基因，将扩增产物插入到pMD18-T载体中，亚克隆至原核表达载体pET28a（+），构建pET28a-ORF3表达载体，转入E.coli BL21 (DE3)，IPTG诱导表达。Ni-NTA层析柱纯化表达蛋白，用SDS-PAGE、免疫印迹、ELISA等方法分析鉴定表达产物。结果成功扩增到345 bp的目的基因；构建了重组表达载体pET28a-ORF3；转化宿主菌E.coli BL21 (DE3)后表达产物的相对分子质量在6.50~16.5 kDa之间，与预期表达的目的蛋白相对分子质量相符；表达的目的蛋白能与阳性猪源和人源血清发生特异性反应,证实其具有较好的反应原性。