基于超滤技术的血塞通注射液的工艺优化

以HPLC和动态浊度法分别检测血塞通注射液超滤前后有效成分及细菌内毒素的含量变化,研究了10 kDa及50 kDa截留分子量的超滤膜对血塞通注射液中有效成分的影响及细菌内毒素的去除效果.结果表明,两种截留分子量的超滤膜均可有效的去除药液中的细菌内毒素,但10 kDa超滤膜对三七总皂苷有效成分有明显损失,50 kDa超滤膜对成分保留率均在95%以上.选用截留分子量为50 kDa的超滤膜即可保留有效成分,又可有效去除细菌内毒素,适用于血塞通注射液的生产.     

肺炎链球菌假想蛋白SPD0873的表达纯化及保守性分析

目的通过构建原核表达载体,获得纯化的肺炎链球菌S．pn重组假想蛋白SPD0873,并制备多克隆抗体,进一步分析其在常见S．pn菌株中的保守性。方法分离培养D39型肺炎链球菌,获取其基因组DNA。利用PCR方法扩增去除信号肽的spd0873序列,采用基因体外重组法将spd0873序列克隆到原核表达载体pET-32（a）内,测序鉴定。将重组质粒转化到E．coli Rossetta（DE3）中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的SPD0873重组蛋白,经Ni—NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白用SDS—PAGE和Western印迹鉴定;将鉴定后纯化的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在5种常见肺炎链球菌分离株的保守性。结果克隆的spd0873序列与GenBank中的数据相符,并实现了SPD0873蛋白高水平的可溶表达。纯化蛋白免疫BALB／C小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western印迹验证SPD0873蛋白在5株常见肺炎链球菌菌株中均有表达。结论成功制备了高滴度、高特异性的SPD0873蛋白多克隆抗体,同时,检测到SPD0873蛋白在5种常见的肺炎链球菌菌株中非常保守,为研究该蛋白的生物学功能及肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础。     

运用酶切自连法分析鉴定肺炎链球菌体内诱导基因

肺炎链球菌是严重侵袭性感染和上呼吸道感染最重要的条件致病菌之一,分析鉴定体内诱导基因序列变得尤为重要。本研究利用酶切自连法成功从129个体内诱导表达的肺炎链球菌中获得13个融合重组自杀质粒,通过与肺炎链球菌株TIGR4基因组序列的同源性比对,共得到10个不同的体内诱导基因,其中8个是从血液中筛选出的,另2个为从肺组织中筛选出;通过分析得到18个开放阅读框,其中大部分为已知功能基因,参与细菌多种生命活动,有2个为未知功能基因,编码假想蛋白。可见,酶切自连法可有效用于筛选基因的分析鉴定。     

肺炎链球菌溶血素黏膜免疫抗定植保护作用的研究

目的原核表达△A146Ply蛋白,评价△A146Ply黏膜免疫对肺炎链球菌（Streptococcuspneumon—ioe,5．Pn）在宿主鼻咽部定植的保护作用。方法IPTG诱导、Ni—NTA树脂纯化获得纯化的△A146Ply蛋白,经黏膜免疫BALB／C小鼠,制备其特异性抗血清;进行体内抗定植实验,观察小鼠鼻咽部灌洗液和肺部残存的细菌数量,检测△A146Ply黏膜免疫对19F型肺炎链球菌在鼻咽部定植的保护作用。为验证该保护作用是否具有广谱性,培养血清型14型、3型、6型和2型S．pn,经鼻腔感染免疫后小鼠,评价△A146Ply蛋白黏膜免疫对多株肺炎链球菌定植的保护作用。进行体外抗黏附实验,检测△A146Ply蛋白及其抗血清是否对无荚膜的肺炎链球菌R6黏附A549细胞具有抑制作用。结果获得了纯度〉90％的目的蛋白;体内实验结果显示,△A146Ply黏膜免疫可以显著降低肺炎链球菌19F在宿主鼻咽部和肺部残存的细菌数量（P〈0．01）;14型和3型肺炎链球菌在免疫后小鼠鼻咽部及肺部定植的数量均显著下降（P〈0．05）,2型肺炎链球菌在免疫后小鼠肺部定植的数量显著下降（P〈0．05）,6B型肺炎链球菌在免疫组与对照组小鼠鼻咽部及肺部均无显著差异（P〉0．05）;△A146Ply特异性抗血清△A146Ply蛋白对R6黏附A549细胞的抑制效应呈剂量依赖性。结论△A146Ply蛋白经黏膜免疫BALB／C小鼠可以对多种血清型的肺炎链球菌在宿主鼻咽部及肺部的定植提供显著保护作用,为Ply作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白的应用提供了实验依据。     

comE基因缺陷影响肺炎链球菌体内诱导基因的表达

【目的】筛选受comE调控的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)体内诱导基因。【方法】通过插入失活构建基因comE缺陷的S.pn菌株,与野生菌株分别腹腔注射BALB/c小鼠,经过体内诱导后取小鼠血,分离细菌提取RNA,用RT-PCR法检测13个体内诱导基因mRNA水平差异。【结果】将RT-PCR结果通过Quantity-one灰度分析,进行配对t检验,显示8个体内诱导基因在缺陷菌株和野生菌株中mRNA表达水平具有统计学差异(P0.05),其中spd-0300、spd-0414、spd-0622、spd-1663、spd-1719、spd-0235、spd-0873受转化上调,spd-1672受转化下调。【结论】筛选出受转化调控的体内诱导基因spd-0300、spd-0414、spd-0622、spd-1663、spd-1719、spd-0235、spd-0873、spd-1672,它们可能参与生长调节、温度感应、糖脂代谢等环节,表明细菌转化可通过调节某些体内诱导基因的表达来增强细菌的毒力。     

clpE基因缺失对肺炎链球菌毒力的影响

【目的】 探索clpE基因缺失对肺炎链球菌毒力的影响。【方法】 用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法失活clpE基因,用PCR、测序鉴定缺失菌株,通过动物实验观察clpE基因缺失株毒力改变情况, 同时用细胞实验比较clpE基因缺失株和野生菌对宿主细胞的粘附和侵袭能力,最后用实时荧光定量PCR分析自溶素(major autolysin A,lytA)、表面黏附素A(pneumococcal surface adhesion A,psaA)、溶血素(pneumolysin,ply)、肺炎球菌表面蛋白A（pneumococcal surface protein A, pspA)和神经氨酸酶（neuraminidase, nanA）的表达。 【结果】小鼠毒力实验表明野生菌株半数致死时间54h,而缺失株半数致死时间为21d,两者比较有统计学差异（P<0 .0l）;缺失菌在对宿主细胞的粘附能力明显低于野生菌株（P<0.05）。实时荧光定量PCR显示clpE缺失株的五个毒力因子mRNA表达水平均低于野生菌,两者比较有统计学差异（P<0. 05）;【结论】ClpE通过调控肺炎链球菌多种毒力因子表达,而影响其毒力。     

假想的脂蛋白连接酶对肺炎链球菌毒力的影响

【目的】探索假想脂蛋白连接酶(putative lipoate-protein ligase,LPL)对肺炎链球菌毒力的影响。【方法】采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)的方法失活lpl基因,通过PCR、测序鉴定缺陷菌株,采用细胞实验比较缺陷菌和野生菌对宿主细胞的粘附能力,并通过动物实验观察lpl基因缺陷后菌株毒力的变化。【结果】小鼠毒力实验表明野生菌株和缺陷株半数致死时间均为12h,两者比较无统计学差异;缺陷菌在对宿主细胞的粘附能力明显高于野生菌株(P0.01);体外荚膜染色实验表明,野生菌和缺陷菌均有荚膜。【结论】实验结果提示lpl基因对细菌粘附宿主细胞有抑制作用,但不影响其腹腔感染小鼠的能力。     

高浓度七氟醚通过抑制VEGF/PI3K/AKT信号通路诱导神经干细胞凋亡的研究

目的探讨妊娠中期的七氟醚暴露对神经干细胞凋亡过程的影响和作用机制。 方法将孕中期大鼠随机分为3组,每组48只孕鼠：对照组,低浓度七氟醚组,高浓度七氟醚组。在妊娠第14天,以2﹪或3.5﹪七氟醚麻醉怀孕大鼠2?h。通过免疫荧光检查神经干细胞凋亡,收集麻醉后6、24和48?h以及出生后第0天（P?0）,第14天（P?14）和第28天（P?28）的脑组织进行Nestin-TUNEL免疫荧光双标染色以及Nestin、血管内皮生长因子（VEGF）和磷酸肌醇3-激酶（PI3K）AKT通路相关蛋白的免疫印迹检测。采用单因素方差分析和Bonferroni事后检验进行统计学分析。 结果麻醉后6、24和48?h以及P?0,P?14和P?28,脑组织中Nestin和TUNEL阳性细胞的百分比增加[6?h：对照组0.91±0.07,低浓度组1.01±0.08,高浓度组2.62±0.21（F?=?399,P?相似文献   

组氨酸激酶(YycG)在筛选肺炎链球菌抑制剂中的应用

为了获得具有体外活性的肺炎链球菌组氨酸激酶YycG并利用其筛选寻找新的抑制剂。原核表达组氨酸激酶YycG的激酶功能域,经SDS-PAGE,Western blot鉴定及镍层析柱纯化后,采用激酶试剂盒检测其激酶活性;利用对其激酶活性的抑制作用从105种候选化合物中筛选有效的抑制剂,并通过实验验证抑制剂的抗菌作用。原核表达得到约35 kDa的目的蛋白激酶域片段YycG′,其纯度达 95 %,并具有体外水解ATP的激酶活性;利用其活性筛选得到数种不同抑制效果的小分子化合物,且体外验证具有较好的抑菌效果。通过肺炎链球菌组氨酸激酶YycG活性筛选找到的小分子抑制剂可为进一步研发与该菌相关的药物或消毒剂提供基础。     

Autotaxin-LPA轴在肥胖及其相关疾病中的作用

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是一种结构简单的生物活性脂质分子,可通过与细胞膜上的LPA受体(lysophosphatidic acid receptors,LPARs)结合参与调控细胞生命活动,在多种生理和病理过程中发挥作用.分泌型糖蛋白Autotaxin (ATX)具溶血磷脂酶D (lysophosphalipase D, lysoPLD)活性,能够催化溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)水解生成LPA,这是循环系统中LPA的主要来源.近几年的研究表明,ATX在成熟脂肪细胞中高表达,ATX-LPA轴与肥胖及肥胖个体的糖脂代谢紊乱有密切的关系,被认为是肥胖相关疾病治疗的新靶点.本文综述了ATX-LPA轴在肥胖、胰岛素抵抗和非酒精性脂肪肝病中的作用及作用机制,为相关领域的基础研究和疾病防治提供新的思路和策略.