乙烯利对青春期大鼠睾丸组织病理及生精细胞凋亡的影响

目的:探讨乙烯利对青春期大鼠睾丸组织病理及生精细胞凋亡的影响。方法:青春期雄性25日龄SD大鼠,分别以乙烯利浓度为2000 mg/kg、1000 mg/kg、500 mg/kg和生理盐水连续灌胃14和21天,分别取睾丸固定、包埋,以HE染色、末端转移酶标记技术(TUNE法)光镜观察睾丸的组织形态学变化、检测生精细胞凋亡情况。结果:低剂量组较对照组相比生精小管萎缩,生精细胞排列紊乱;中剂量和高剂量组较低剂量组相比,生精小管更加萎缩,生精细胞排列明显紊乱;接触乙烯利14天后高剂量组生精细胞凋亡指数与低剂量、对照组相比具有显著统计学差异(P0.01);高剂量与中剂量组相比无统计学差异(P0.05);中剂量和低剂量与对照组相比有显著统计学差异(P0.01);接触乙烯利21天后各组间比较均具有显著性差异(P0.01)。结论:乙烯利可导致大鼠生精细胞凋亡增加,生精能力下降,这可能是导致青年不育的原因之一。     

基于萤火虫荧光素酶报告基因检测凋亡的系统构建及鉴定

为构建一个能够快速检测凋亡的含荧光素酶报告基因 (Fluc) 的真核表达质粒,采用PCR的方法将Caspase-3的识别基序Asp-Glu-Val-Asp (DEVD) 四个氨基酸引入至Fluc基因的C端和N端之间;同时选取Asp-Glu-Val-Gly (DEVG) 四个氨基酸作为阴性对照。随后重组片段分别克隆至分离型内含肽的N端和C端之间,并命名为pFluc-DEVD和pFluc-DEVG。将该表达质粒与海肾荧光素酶报告质粒 (RLUC) 同时转染至HeLa细胞,通过双荧光素酶报告基因和Western blotting实验检测细胞凋亡水平。双荧光素酶报告基因系统实验结果显示,当发生凋亡时,pFluc-DEVD质粒组表达的萤火虫荧光素酶的含量高出pFluc-DEVG质粒组约3倍。Western blotting检测结果显示,转染pFluc-DEVD质粒的细胞在凋亡药物刺激后,Fluc活化的蛋白显著增多,且Caspase-3 的活化程度与Fluc的表达呈正相关,并有显著的统计学差异。以上结果表明,pFluc-DEVD真核表达质粒表达的萤火虫荧光素酶蛋白能被细胞内的Caspase-3酶裂解,且该质粒能够精确地反映出细胞的凋亡水平,为后续进行凋亡定量检测提供了一个可借鉴的方法。     

原子力显微镜在测定颗粒与细胞相互作用中的应用

凭借独特的尺寸效应和理化性质,纳微颗粒在生物医药领域的应用日益广泛,其与细胞的相互作用也备受关注,对其进行定量测量和机制研究愈发重要。目前,原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)由于具有高灵敏度(皮牛级)、高分辨率(纳米级)以及在生理环境中可进行实时检测等优势成为检测颗粒与细胞相互作用的重要工具。利用AFM检测颗粒与细胞相互作用,有助于确定作用过程中的重要参数,解释颗粒在药物递送、免疫响应和细胞力学等应用方面深层次的机制。本文中,笔者就原子力显微镜检测颗粒与细胞相互作用及其应用进行系统的综述,并对其未来的发展方向进行展望。     

MDV-1 VP22羧基端在大肠杆菌中高效可溶性表达

VP22是血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的复制和传播必不可少的组分。本研究从MDV-1无致病性的CVI988/Rispens疫苗感染的鸡胚成纤维细胞DNA中扩增得到VP22基因,并在大肠杆菌中表达其C端功能区。SDS-PAGE电泳发现,VP22C端得到高效可溶性表达,大小为42kDa左右。将获得的阳性条带经切胶免疫和细菌超声波裂解的上清作为抗原免疫6周龄Balb/C小鼠,均能诱导产生特异性抗VP22C端抗体。通过免疫荧光试验,检测到VP22在感染MDVCEF所有细胞核中呈特异性表达。这一抗体对深入研究VP22蛋白转导功能起到重要的作用。     

MDV-1 VP22羧基端在大肠杆菌中高效可溶性表达

VP22是血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV-1)的复制和传播必不可少的组分.本研究从MDV-1无致病性的CVI988/Rispens疫苗感染的鸡胚成纤维细胞DNA中扩增得到VP22基因,并在大肠杆菌中表达其C端功能区.SDS-PAGE电泳发现,VP22 C端得到高效可溶性表达,大小为42kDa左右.将获得的阳性条带经切胶免疫和细菌超声波裂解的上清作为抗原免疫6周龄Balb/C小鼠,均能诱导产生特异性抗VP22 C端抗体.通过免疫荧光试验,检测到VP22在感染MDV CEF所有细胞核中呈特异性表达.这一抗体对深入研究VP22蛋白转导功能起到重要的作用.     

MDV-1 VP22增强鸡传染性法氏囊炎病毒VP2 DNA免疫作用

马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）被膜成分中的VP22具有蛋白转导功能．将鸡传染性法氏囊炎病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2与MDV—VP22同时插入pcDNA3．1构建融合蛋白表达载体,在COS-1细胞中进行暂态表达．结果表明：VP22并不能促进VP2向周围未转染细胞转导,即VP22对VP2没有明显的蛋白转导作用,相反,VP2影响VP22在细胞内的正常定位．然而,通过小鼠股四头肌免疫注射PEI包裹的裸质粒DNA进行DNA免疫,以间接ELISA测定VP2抗体效价,FACS检测T细胞亚类．发现,虽然VP22没有明显促进VP2的体液免疫应答,但脾脏淋巴细胞分群结果表明,VP22-VP2融合蛋白表达载体免疫组和VP2质粒免疫组的CD3^＋T细胞数量显著高于eGFP-VP2组和对照组（P〈0．05）,融合蛋白表达载体免疫组小鼠CD8^＋／CD4^＋T细胞的比例与VP2质粒免疫组相比,明显增强（P〈0．05）,与对照组相比差异极显著（P〈0．01）．这表明VP22对VP2的特异性细胞免疫反应具有一定增强作用．     

MDV-1 CVI988/Rispens疫苗毒体外感染期间VP22的表达及细胞间转导作用

利用CVI988 VP22蛋白C端94~243 aa片段作为抗原制备特异性抗体, 并用于检测MDV-1不同毒株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)时, 在不同感染时间内的表达情况. 结果发现, 当感染量PFU=50时, MDV各不同致病力的毒株(GA, RB1B和CVI988株)VP22最早在3 h时开始向病毒感染细胞的邻近细胞核内扩散; 8 h时, VP22几乎扩散到所有细胞的核内. 这说明VP22在感染细胞形成空斑之前就已经开始表达, 并高效转导入其他正常的细胞核内. 实验中发现血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)弱毒株CVI988/Rispens的VP22蛋白缺失²⁰¹TKSERT²⁰⁶. 结果证实这一缺失对VP22蛋白转导功能并没有明显影响, 即CVI988 VP22仍具有高效的细胞内转导作用. 这为深入研究和开发MDV CVI988株的VP22蛋白转导功能奠定了基础.