羊驼线粒体12srRNA/tRNA-Val/16rRNA 基因序列测定及分子进化研究

对GaneBank中登录的部分骆驼科动物线粒体12 srRNA/tRNA-Val/16 rRNA基因序列进行同源性比较,并借助DNAstar软件设计引物,扩增并进行序列分析,旨在揭示其遗传变异的规律。PCR条件优化后成功扩增出长度为1 014 bp的DNA片段,b lastn分析显示,该片断与骆驼科动物的同源性高于95%,所获得片断包括30bp的12 srRNA基因部分序列,71 bp的tRNA-Val基因全序列和913 bp的16 srRNA基因部分序列。利用RNA-structure 4.2 RNA分析软件绘制了部分骆驼科动物的线粒体tRNA-Val推导性二级结构图,比较结果显示,羊驼线粒体tRNA-Val氨基酸臂和反密码子环呈属间特异性遗传。     

羊驼皮肤cDNA文库构建及鉴定

采用原核表达载体pet-32-a 构建了羊驼皮肤组织cDNA文库。双链cDNA采用Universal Ribo Clonec DNA Synthesis System合成,并经过琼脂糖分级胶回收,去除了小于400 bp的片断;通过酶切载体的去磷酸化和插入片断的磷酸化,提高了重组率,蓝白斑筛选结果全部为阳性;库扩增后检测容量达2.25×107。随机挑取阳性克隆进行单引物测序分析,七个测序样品中获得两个与毛发生长相关的EST(expression sequence tag),分别为S100钙离子结合蛋白A3基因(S100 calcium binding protein A3,S100A3)的部分序列和高硫角蛋白关联蛋白基因(high sulfur keratin-associated protein,KRTAP3-3)的部分序列,说明所构建的文库具有较高的代表性。     

催乳素受体基因与羊驼繁殖性能关系的初探

通过氯仿/异戊醇法制备羊驼血液基因组DNA,采用PCR方法首次扩增出羊驼催乳素受体基因(prolactin receptor gene,PRLR)exon8-exon9序列(GenBank登录号为DQ198164),该片段长度为622bp。通过NCBI blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比较,结果表明:该序列包括exon8的82bp、intron8全序列472bp和exon9的68bp。同源性比较发现,羊驼PRLR基因exon8和exon9核苷酸序列与其它哺乳动物的相应区域的同源性特高,均≥92%;同时还发现羊驼exon8引物后第19个碱基为G,而其它哺乳动物(猪除外)均为A,猪则是在羊驼exon8引物后的第34个碱基处由G变为A,通过推导氨基酸序列分析发现,这种单碱基的突变使得羊驼与其它哺乳动物相比,该处的氨基酸由亮氨酸取代了异亮氨酸;在羊驼exon9引物前第22个碱基处也发生了A-G碱基替换现象,但这个碱基的突变发生在密码子的第3个碱基上,编码的氨基酸均为脯氨酸。在这些动物中只有羊驼为单胎动物,羊驼exon8核苷酸序列中A-G的碱基替换并引起编码氨基酸序列发生改变是否与羊驼繁殖性能有关还有待进一步研究。     

羊驼催乳素基因cDNA克隆及序列分析

实验通过克隆分析羊驼催乳素基因的部分序列,对羊驼催乳素基因的结构和功能进行初步探索和揭示。从GeneBank中已报到的脊椎动物催乳素基因保守区设计一对引物,采用Trizol法提取羊驼胎盘总RNA,利用RT-PCR技术扩增出长度约为510 bp的片断。测序后在NCB I工作平台中进行BLASTn同源性比较,得出结论:羊驼催乳素基因与已登录的哺乳动物催乳素基因同源性均超过85%,最高达97%。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图,并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。。     

羊驼显性白毛调控KIT基因的分子克隆及在大肠杆菌中的表达

为研究羊驼显性白毛调控基因的结构特点及体外表达产物的生物活性,利用RT-PCR技术,首次从羊驼皮肤组织中扩增出羊驼KIT基因exon10-14 cDNA编码序列。结果表明:羊驼KIT基因exon10-14 cDNA长414bp,包括30 bp的exon10、127 bp的exon11、125 bp的exon12、91 bp的exon13和41 bp的exon14(全长151 bp),编码含138个氨基酸残基的蛋白;羊驼与牛、羊、猪、人、马等相比,核苷酸的同源性分别为94%、93%、93%、92%、92%,氨基酸的同源性均大于97%。构建了原核表达载体pET-32a( )-KIT,转化大肠杆菌DH5α,在异丙基硫代半乳糖苷诱导下表达KIT蛋白。结果表明:羊驼KIT基因在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达,融合蛋白分子量约为36 kD,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%。     

显性白毛调控基因在不同毛色羊驼皮肤中表达差异的研究

为了研究KIT基因对羊驼毛色的影响及在不同毛色羊驼皮肤中的表达差异,实验在分析羊驼KIT基因结构的基础上,自行设计表达引物,将羊驼KIT基因exon10-exon14成功定向克隆入原核表达载体pET-32a( )中,构建了KIT基因的重组表达质粒pET-32a( )-KIT.同时进行诱导表达,并以纯化的重组蛋白为免疫原,采喟长程免疫程序免疫兔子,成功制备兔抗羊驼多克隆抗体,从而进行免疫组化分析.结果表明:(1)羊驼KIT基因exon10-exon14编码含138个氨基酸残基的蛋白;(2)SDS-PAGE电泳结果显示重组表达质粒pET-32a( )-KIT诱导下,表达的KIT蛋白为可溶性蛋白;(3)免疫组化研究表明,白毛色羊驼皮肤毛囊内根鞘周围组织有KIT蛋白的表达,外根鞘和结缔组织也有少量表达,而黄色羊驼皮肤毛囊周围即内外根鞘则不表达KIT蛋白.