大肠杆菌α-溶血素分泌系统基因表达调控研究进展

引起人泌尿道感染的大肠杆菌(UPEC)的α-溶血素分泌系统属于Ⅰ型分泌系统,能够分泌一种RTX毒素蛋白-α-溶血素。近年来α-溶血素分泌系统的应用日益广泛,特别是在减毒活载体疫苗中呈递外源抗原。本分析了大肠杆菌α-溶血素分泌系统的遗传特性,详细介绍了其基因的表达调控,为构建更加有效的分泌型载体提供了理论基础。     

基于新月柄杆菌RsaA外运机制的EspA及EspA-IL-24融合蛋白胞外分泌表达研究

目的：实现大肠杆菌分泌蛋白（Esp）A及EspA与白细胞介素（IL）-24融合蛋白的胞外分泌表达，进一步验证基于新月柄杆菌RsaA外运机制的原核胞外分泌表达载体系统的有效性和通用性，并改造优化该系统。方法：利用分子克隆手段，按RsaA分泌系统操纵子组织方式，将获得的RsaA系统元件编码序列和异源调控序列克隆至pQE30骨架质粒，构建新的胞外分泌表达质粒pQABP2S；以大肠杆菌为宿主菌诱导表达EspA及EspA-IL-24融合蛋白，并通过Westernblot检测目标蛋白在培养上清中的表达。结果：获得了新的胞外分泌表达载体pQABP2S；与对照相比，该载体宿主系统培养上清中目标蛋白EspA及EspA-IL-24的表达量明显增加。结论：在大肠杆菌中通过RsaA分泌系统可实现分子大小不同的EspA及EspA-IL-24融合蛋白的特异性分泌表达，进一步证实该分泌表达策略的有效性和通用性；调整调控序列以优化分泌系统的尝试，为此类基因工程技术平台的开发提供了借鉴。     

新月柄杆菌RsaA分泌系统用于大肠杆菌胞外递送重组蛋白的初步研究

目的：构建基于新月柄杆菌RsaA外运机制的以大肠杆菌为宿主的原核胞外分泌表达载体系统。方法：利用分子克隆手段，按RsaA分泌系统操纵子组织方式，将RsaA系统外运功能基因配合以异源调控序列克隆至pQE30骨架质粒。以绿色荧光蛋白（GFP）为报告分子、大肠杆菌M15为宿主茵，诱导表达后通过Western Blotting检测培养上清中GFP的表达。结果：获得了与设计完全一致的pQABPS载体，利用该载体系统，在培养上清中报告分子GFP的表达明显增加，且是通过特异的RsaA外运机制被分泌至胞外的，而非渗漏表达或简单的信号肽引导。结论：在大肠杆菌中重现了RsaA分泌系统的外运功能，为该系统在基因工程领域的应用研究打下了良好基础。