玉米JAZ家族基因ZmJAZ4的克隆及功能分析

JAZ(Jasmonate ZIM-domain)蛋白是植物特有的一类转录因子,通过抑制茉莉素调控基因的表达,在植物的生长发育及非生物胁迫等方面发挥重要的功能。从玉米B73自交系中克隆到一个新的JAZ家族基因Zm JAZ4,该基因c DNA全长为651bp,编码蛋白含有216个氨基酸,分子量约为23.1 k D,p I为10.78,属于碱性蛋白。Real-time RT-PCR结果表明,Zm JAZ4主要在茎端分生组织、雄穗、发育早期的种子以及胚乳中表达。系统进化分析显示,Zm JAZ4与At JAZ10转录因子相似性较高。亚细胞定位试验表明,Zm JAZ4定位于细胞核内。Zm JAZ4在酵母细胞中不具有转录激活活性。激素及胁迫处理表明,Zm JAZ4在地上部的表达受PEG、Na Cl、SA、GA和ABA诱导,而在地下部的表达受到ABA和GA诱导。结果分析表明,Zm JAZ4可能是一个重要的转录调控因子,参与调控多种激素信号通路及非生物胁迫响应。     

ZmJAZ与ZmMYC2的BiFC互作研究

JAZ(jasmonate ZIM-domain)蛋白是茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径中关键的负调控因子,明确JAZ蛋白和MYC2之间的结合关系对整个JA信号通路至关重要.通过qRT-PCR筛选了在籽粒中较特异表达的ZmJAZ4、生殖器官中高表达的ZmJAZ8以及组成型表达的ZmJAZ12,利用玉米...     

玉米中ClassⅠ和ClassⅡ NAS蛋白之间的BiFC互作研究

烟草胺合成酶（nicotianamine synthase,NAS）能够催化合成植物体内铁运输所需的螯合物烟草胺（nicotianamine,NA）,在植物维持铁稳态方面发挥重要的作用。玉米、小麦和大麦等禾本科植物的NAS蛋白进化为ClassⅠ和ClassⅡ两个亚家族,可能分别参与调节铁的吸收和运输,其家族成员之间蛋白序列同源性较高,ClassⅡ NAS具有特异的N端可变结构域。通过进化分析分析玉米NAS的两个亚家族,以及建模预测两类亚家族代表基因ZmNAS1（ClassⅠ）和ZmNAS3（ClassⅡ）的蛋白结构,结果表明ZmNAS1和ZmNAS3的三维结构高度相似,推测可能通过同源或异源二聚体化发挥功能;进一步通过双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）分析ZmNAS1和ZmNAS3的相互作用,结果表明,ZmNAS1和ZmNAS3蛋白可以互作,删除N端可变结构域的ZmNAS3?N只能与ZmNAS3蛋白互作而不与ZmNAS1互作,推测ZmNAS可以形成同源二聚体,而形成异源二聚体需要ClassⅡ家族蛋白的N端可变结构域。研究结果揭示了玉米中ClassⅡ NAS调控铁稳态的机制,其分子机制仍需进一步研究。     

转基因玉米中植酸酶蛋白免疫亲和纯化体系的建立

为深入研究转基因玉米所表达的植酸酶蛋白的酶学性质,评价重组蛋白的致敏性和饲用安全性,必须获得高纯度植酸酶蛋白.利用识别4个不同表位的单克隆抗体制备了植酸酶蛋白亲和层析体系.结果显示,通过80％硫酸铵沉淀植酸酶蛋白粗提液初步浓缩目的蛋白后,再经过透析去除高浓度盐离子,进而通过免疫亲和层析可获得在SDS-PAGE胶上条带单一的植酸酶蛋白,比活可达470.99 U/mg.同时,将上述免疫亲和层析法对植酸酶的纯化效果与离子交换层析方法进行了对比,结果表明免疫亲和层析法具有稳定、快速和纯化产物比活高等优势,所获得的目的蛋白满足各种检测要求,优于离子交换层析方法.     

玉米ZmCI-1B启动子及其7个5'端缺失体在转基因拟南芥中的活性分析

将ZmCI-1B全长启动子及其7个5'端缺失的启动子片段的表达载体分别转化农杆菌GV3101,经PCR鉴定正确之后,以拟南芥为遗传转化受体,利用花序侵染法将各个表达载体转化拟南芥。用PCR法检测转化后的拟南芥植株,取阳性植株的幼苗或花、角果进行GUS组织化学染色。结果表明,ZmCI-1B启动子在拟南芥中的调控特性与玉米中的不同;ZmCI-1B启动子及其7个5'端缺失启动子转基因拟南芥植株中GUS的染色部位各异,说明了不同长度的启动子功能特性不同,推测其可能与启动子上的顺式作用元件有关。     

植物JAZ蛋白的功能概述

茉莉酸作为重要的植物激素,在植物生长、繁殖和抗逆等诸多方面起重要的作用。茉莉酸途径的抑制因子JAZ(Jasmonate ZIM-domain,JAZ)蛋白(JAZs)是调节茉莉酸(JA)激素应答的关键因子,在没有JA存在时,JAZs抑制DNA-结合转录因子活性,从而调控JA应答基因转录;当有JA存在时,JAZs和冠菌素不敏感1(Coronatine insensitive 1,COI1)依赖JA分子发生互作,复合体被SCFCOI1识别并进入26S蛋白酶解途径降解,释放的转录因子启动JA应答基因转录。随着研究的深入,发现JAZs可以与许多转录因子互作,不仅调控了JA信号响应,还参与了其他激素信号通路。对JAZs的互作机制进行描述,阐述JAZs在植物激素调控网络中的作用。     

通过荧光标记的凝胶阻滞技术分析Opaque2蛋白与ZmGRAS11启动子的结合位点

凝胶阻滞实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是研究蛋白质与核酸结合的一种关键实验技术。EMSA技术兴起以来，使用放射性同位素、生物素标记核酸探针的手段已经非常成熟，但这两种传统的标记技术分别具有放射性探针稳定性差和生物素检测步骤复杂等缺点。近年来，尽管荧光标记探针逐渐被应用于EMSA中，但是对于利用荧光标记探针的EMSA仍缺乏系统的报道。对荧光标记的EMSA技术流程进行了优化和系统总结；利用6-羧基荧光素（6-carboxy-fluoroscine，FAM）标记ZmGRAS11启动子探针，通过EMSA检测其与Opaque2蛋白的结合，明确了蛋白和探针的适宜比例为8∶1。对GCN4 motif序列碱基进行突变并利用EMSA分析Opaque2与ZmGRAS11启动子之间的结合位点，结果表明GCN4 motif的“TGAC”核心基序在ZmGRAS11启动子与Opaque2蛋白的结合中可能起到了关键作用。研究结果为进一步探究Opaque2-ZmGRAS11转录调控模块在玉米籽粒发育中的作用机理提供了数据支撑。