香港瘰螈eDNA引物和TaqMan探针的设计与确认

环境DNA（eDNA）技术是近年来新兴的一种野外水生生物调查方法。本研究旨在设计一组香港瘰螈（Paramesotriton hongkongensis）特异的引物和TaqMan探针并确立此eDNA方法在水样中的实用性,以期进一步调查其野外种群分布。测定11种瘰螈物种的线粒体细胞色素b（Cyt b）基因序列,然后使用Primer Express 3.0软件设计引物和TaqMan探针。通过比对NCBI基因库及进行退火温度梯度测试,验证引物和TaqMan探针的特异性。通过测试不同浓度的引物和TaqMan探针,优化qPCR扩增效率。然后检测养殖不同数量香港瘰螈的水缸水体中eDNA,以评估已建立的qPCR方法灵敏度。同时,测定香港瘰螈eDNA降解速度,以估计其在水中的持续时间。实验结果显示,本研究所设计的引物和探针只对香港瘰螈呈阳性扩增,而对同属的其他10个物种均呈阴性。优化的qPCR效率为93.9%、最低检测浓度为10 DNA拷贝数。已建立的qPCR方法能灵敏地检测出在养殖1只香港瘰螈24 h实验水缸水体的DNA拷贝数为（13.56 ± 3.35）/ml水样。另外,降解实验发现,采用0.45 μm孔径滤膜已有效检测香港瘰螈eDNA并能监测15 d。本研究成功设计并建立了一种能在水环境中检测香港瘰螈是否存在的eDNA技术,以期应用于野外考察。