新生期反复惊厥对认知和海马CaMKⅡ表达的远期影响及干预研究

新生期惊厥活动可造成严重的神经后遗症,如成年期大脑对惊厥的易感和易损性提高,严重者产生认知功能损害.对发育期惊厥性脑损伤远期预后的研究,尤其是分子机制及其干预的研究具有重要的临床意义.探讨了新生期大鼠单次长程或反复惊厥对学习、记忆能力和海马突触后致密物质钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达的远期影响及运动训练的干预作用.生后6天(P6)的SD大鼠随机分成单次长程惊厥组(SS)、反复惊厥组(RS)和对照组,每组12只.3组大鼠分别于P27～P31、P58～P61、P80～P82采用Morris水迷宫检测学习、记忆功能.P51～P56对SS组和RS组进行踏转轮训练.最后脑组织切片观察CaMKⅡmRNA在海马的表达.结果显示,第一次Morris水迷宫测试RS组第1天～第4天潜伏期明显高于对照组,具有显著性差异(P＜0.05),第二次水迷宫RS组第1天～第2天的逃避潜伏期较对照组仍显著延长,具有显著性差异(P＜0.05),第三次测试各组之间差异无统计学意义.搜寻策略显示,在第一次Morris测试时RS组第3天～第4天边缘式搜寻比例明显高于对照组,具有显著性差异(P＜0.01),同时RS组第3天～第4天趋向式搜寻比例明显低于对照组,具有显著性差异(P＜0.01),而第二次和第三次水迷宫测试3组间趋向式和直线式搜寻策略无明显差异.在记忆实验中,原平台象限游泳距离与总距离的比值,RS组第三次较对照组显著降低,有统计学意义(P＜0.05);另外RS组1～3天趋向式搜寻比例均明显低于对照组,有显著性差异(P＜0.05).CaMKⅡ原位杂交显示,各组CaMKⅡmRNA在海马均有明显表达,但是在齿状回和门区RS组表达明显低于对照组,具有统计学意义(P＜0.01).研究表明,新生期反复长程惊厥能够对学习和记忆功能产生远期的损害,可能与海马记忆分子CaMKⅡ表达下调有关,而单次长程惊厥对学习记忆无明显影响.早期运动训练能够明显改善反复惊厥所致的学习能力损害,但对记忆能力效果仍较差.     

听源性遗传癫痫易感大鼠大脑皮层胆囊收缩素mRNA的原位杂交检测

本实验用原位杂交法,对听源性遗传癫痫易感大鼠（P77PMC)癫痫发作前,单次癫痫发作和多次发作时大脑颞皮层CCK mRNA阳性信号进行了检测,结果显示：（1）单次和多次癫痫发作后颞皮层CCK mRNA阳性神经元数量明显增加（P＜0．01）;（2）多次癫痫发作者上述脑区CCK mRNA阳性神经元数量较单次癫痫发作有明显的下降（P＜0．01）,大脑颞皮层CCK mRNA增高表明,CCK mRNA在癫痫发作过程中起了某种作用,多次癫痫发作大鼠CCK mRNA表达降低提示,单次和多次癫痫发作时大脑皮层CCK mRNAl转录的调控可能存在不同的机制。     

糖尿病大鼠脑细胞周期依赖性蛋白激酶5和蛋白激酶A参与调节Tau蛋白磷酸化

细胞周期依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5,Cdk-5)及蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)是调节Tau蛋白磷酸化的重要激酶,其对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠脑内Tau蛋白磷酸化的作用如何,目前尚不明确.为探讨胰岛素缺乏的DM大鼠海马Cdk-5及PKA对Tau蛋白磷酸化的作用,用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立DM大鼠模型,Fura-2负载及荧光测定细胞内游离Ca2 浓度,免疫沉淀法测定Cdk-5活性,放射性配体结合实验检测PKA的活性,蛋白质印迹检测Tau蛋白磷酸化的水平.结果提示:在DM大鼠海马神经元,Ca2 浓度升高,Cdk-5及PKA活性升高,Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202和Ser396/Ser404位点的磷酸化增强.Cdk-5的特异性抑制剂roscovitine可降低DM大鼠Cdk-5活性,但不能降低PKA活性,使Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202位点磷酸化水平降低,但不降低Ser396/Ser404位点的磷酸化,roscovitine处理正常大鼠后,上述酶的活性及Tau蛋白的磷酸化无明显变化.首次从整体水平上证实DM大鼠海马Cdk-5及PKA活性升高,协同促进Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202位点和Ser396/Ser404位点的磷酸化,神经元内游离Ca2 浓度升高可能起重要作用.     

幼年大鼠青霉素点燃后慢性认知功能缺陷的分子机制研究

在建立发育期大鼠青霉素点燃模型的基础上,探讨点燃后至成年期不同发育阶段空间学习记忆能力改变,以及对海马记忆分子钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα)、突触可塑性相关基因3(PRG-3)、抗惊厥脑肠肽胆囊收缩素(CCK)、锌离子转运体1(ZnT-1)和3(ZnT-3)表达的远期影响．生后29天(P29) 的SD大鼠随机分为青霉素点燃模型组(RS组,n=39)及生理盐水对照组(NS组,n=21)．RS组隔日腹腔注射青霉素,按体重5.60×10⁶ U/kg,连续6次,NS组以同样方法腹腔注射生理盐水．于末次惊厥后1.5、3、6和12 h透射电镜观察海马凋亡及自噬,于末次惊厥后1 h进行脑电记录,于末次惊厥后24 h 原位末端标记凋亡法(TUNNEL)检测海马凋亡细胞．分别于P51～P56、P81～P84、 P92～P95 进行3次Morris水迷宫实验,检测大鼠的学习记忆能力．最后,采用Timm染色观察海马苔藓纤维发芽,实时定量RT-PCR测定海马CaMKⅡα、PRG-3、CCK、ZnT-1和ZnT-3的表达．结果如下：a．电镜显示末次惊厥后1.5～12 h可见大鼠海马本部神经元内溶酶体被激活,自噬小体形成,12 h自噬和凋亡同时存在;TUNNEL显示凋亡细胞明显增多(P < 0.05)．b．RS组末次惊厥后3～5 min脑电图记录显示额叶丛集放电,棘波和尖波阵发．c．Morris水迷宫实验显示,第1次测试各组逃避潜伏期均呈逐渐下降趋势,但RS组第5天潜伏期明显高于NS组,具有显著性差异(P < 0.05),RS组第2次水迷宫测试中第1天潜伏期明显高于NS组,具有统计学意义,第3次水迷宫第2天的潜伏期仍明显高于NS组,具有统计学意义．d．在Morris水迷宫搜寻策略分析中采用秩和检验,第1次水迷宫对照组在第4天和第5天成绩明显优于RS组,具有统计学意义(P < 0.01),第2次和第3次水迷宫中对照组3天成绩均明显优于RS组,具有统计学意义(P < 0.05)．e．Morris记忆实验显示：3次记忆测试平台象限路径与总路径之比,RS组3次记忆测试均明显低于NS组,有显著性差异(P < 0.05)．f．Timm染色显示,RS组海马齿状回内分子层和CA3区锥体细胞层可见明显异常增生苔藓纤维,对照组未见发芽．g．在实时定量RT-PCR试验中,方差分析显示RS组海马CaMKⅡα和ZnT-1表达明显低于NS组(P < 0.05),聚类分析和相关分析表明,NS组CaMKⅡα、PRG-3、CCK、ZnT-3这4个基因具有共聚特征,并且各个基因之间具有显著相关性,而RS组仅海马CaMKⅡα和ZnT-1具有明显的共聚现象且呈正相关．本研究表明,幼年大鼠青霉素点燃后不仅能够造成海马神经元早期损伤(包括自噬和凋亡增加),而且产生远期的学习和记忆功能损害,并可能与海马记忆分子CaMKⅡ及ZnT-1表达下调有关．     

应用PCR技术检测媒介恙螨体内恙虫病立克次体(英语)

本文PCR技术的引物是参考恙虫病立克次体Karp株Sta 58序列设计合成的一对DNA引物.以恙虫病立克次体DNA为模板,成功扩增长约1kb的DNA片段.该对引物首次应用于人工成虫腹内接种羔虫病立克次体(人工接种法)和幼虫叮咬恙虫病鼠(叮咬病鼠法)的我国主要恙虫病媒介地里纤羔螨的研究.PCR检测人工接种法成虫的不同时期和经卵传递的子代立克次体DNA均获满意结果,立克次体在恙螨体内生长持续360天及产卵孵出的第4代幼虫均呈阳性.叮咬病鼠法立克次体在恙螨亲代饱食蚴、若蛹、若虫、成虫及第2代子产代幼虫,PCR检测均呈阳性.结果显示PCR技术检测恙螨体内恙虫病立克次体的特异性和敏感性高;体外基因扩增检测恙螨体内及鼠宿主体内立克次体是流行病学调查的新的敏感方法.本法为恙虫病分子体流行病学调查提供了新的应用技术,亦为临床病人诊断提供了敏感方法.