不同细菌刺激后仿刺参体腔液中免疫相关酶的应答变化

为了解不同细菌刺激后仿刺参(Apostichopus japonicus)体腔液中免疫因子的应答变化,分别用灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifacien)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和停乳链球菌(Streptococcus dysgadysgalactiae)注射刺激仿刺参,然后分别采用对硝基苯基磷酸酯(p NPP)底物法、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法、溶壁微球菌粉法和多巴络合物生成法对体腔液上清中的酸性磷酸酶(ACP)与碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LYZ)和酚氧化酶(PO)的活力进行了测定。结果显示,灿烂弧菌刺激后,酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力显著升高,而超氧化物歧化酶、溶菌酶和酚氧化酶活力显著降低;哈维氏弧菌刺激后,酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶和酚氧化酶活力显著升高,碱性磷酸酶活力变化不规律;假交替单胞菌刺激后,酸性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶活力显著升高,超氧化物歧化酶活力先升高后降低,碱性磷酸酶活力变化不规律;溶壁微球菌刺激后,酸性磷酸酶和酚氧化酶活力显著升高,超氧化物歧化酶活力先升高后降低,溶菌酶活力先升高后降低,而后在72 h恢复至对照水平,碱性磷酸酶活力变化不规律;停乳链球菌刺激后,除碱性磷酸酶活力在4 h有所下降外,其余免疫相关酶活力均显著升高。研究结果表明,酚氧化酶是仿刺参非特异性免疫系统中最敏感、高效的免疫因子之一;革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌之间在诱导仿刺参免疫因子应答变化上无明显规律性差异;溶壁微球菌诱导溶菌酶的应答变化与灿烂弧菌、哈维氏弧菌、假交替单胞菌和停乳链球菌存在明显差异,溶菌酶可能是仿刺参清除入侵溶壁微球菌的主要免疫因子;灿烂弧菌诱导仿刺参免疫因子应答变化显著不同于其他4株细菌,显示出本研究选取的5个免疫指标在预警灿烂弧菌病害上具有潜在应用价值;停乳链球菌在仿刺参中具有作为免疫增强剂的潜在应用价值。     

Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达及其免疫血清的制备

目的原核表达、纯化II型登革病毒NS1A蛋白(NS1蛋白1～180氨基酸即DENV2 NS1A),将其免疫动物制备免疫血清并鉴定。方法构建重组融合质粒p ET22b-p64K-L-DENV2 NS1A,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG低温诱导表达。表达的融合蛋白经Hitrap Talon crude柱亲和层析纯化后,免疫雌性日本长耳兔获得抗DENV2 NS1A兔抗血清,用Western blot和免疫荧光检测免疫血清对重组麻疹病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6Xhis的识别和结合特性。结果重组融合质粒p ET22b-p64K-L-DENV2 NS1A经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组融合蛋白相对分子质量为100 000,纯化后蛋白纯度在85%以上,免疫获得的抗DENV2 NS1A兔抗血清可识别重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis表达的DENV2 NS1蛋白。结论原核表达并纯化了DENV2 NS1A蛋白,建立了基于NS1蛋白的重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis的Western blot和免疫荧光检测方法,为登革热疫苗研制中重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis的质检奠定了基础。