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1.
质粒pcDNA3—HGF的大规模纯经制备研究   总被引:8,自引:2,他引:6  
质粒pcDNA3-HGF具有潜在的临床治疗缺血性疾病的应用前景。大规模纯化制备是质粒DNA应用于基因治疗的关键步骤。质粒大规模纯化制备流程包括:发酵、离心收集细胞、碱性裂解、Q-Sepharose XL捕获质粒DNA、Source 15Q精制质粒DNA,所得纯超螺旋质粒pcDNA3-HGF符合质量标准。该纯化制备方法避免使用动物源性的酶及有毒试剂。  相似文献
2.
重组质粒pUDKH的质量分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:分析研究pUDKH的质量。pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。方法:用光密度法分析pUDKH的浓度及纯度;用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋pUDKH比例及RNA;以地高辛标记的核酸探针固相斑点杂交法测定残留宿主DNA含量;用酶联免疫法测定残留宿主菌蛋白;以4组限制性内切酶分析一致性;PCR扩增目的基因片段;抑菌圈测定板测定残余抗生素;用鲎试剂检测细菌内毒素;对CHO细胞进行基因转染;ELISA检测上清HGF表达量;用Transwells法分析表达的上清液诱导ECV304细胞迁移数。结果:03批次pUDKH的浓度为1.97mg/mL,D260nm/D280nm值为1.84,超螺旋pUDKH比例为95.5%;电泳图谱中未见RNA;残留宿主DNA含量低于质粒DNA的0.2%;菌体蛋白质残留含量低于质粒DNA的0.1%;限制性酶切图谱与自行制备的对照品一致;PCR扩增到HGF基因片段,长约2.2kb;未见残余抗生素(卡那霉素)抑菌圈;细菌内毒素≤0.03125EU/mL;转染的CHO细胞上清HGF表达量为39.32ng/mL;表达的上清诱导ECV304细胞迁移数高于对照组2倍。结论:03批次pUDKH的质量符合药学规格。  相似文献
3.
质粒治疗肢体动脉闭塞性疾病的安全性分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
肢体动脉血管闭塞性病是一种严重危害人类健康的疾病,许多病人最终要截肢,基因治疗为这类患带来了希望。利用肝细胞生长因子促进血管生成的作用,采用质粒作为载体对大鼠和故事片诉下肢动脉闭塞疾病模型进行治疗,效果良好。为探讨基因治疗的安全性问题,用绿色荧光蛋白报告基因研究质粒在体内的分布和表达,方法简便。通过制作冰冻切片观察绿色荧光蛋白在小鼠体内的表达情况发现局部注射质粒不会造成全身性扩散,表明该方法安全。  相似文献
4.
重组中国汉族人源γ-干扰素的纯化和鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
E.coli中高表达的中国汉族人源γ-干扰素是以包涵体的形式存在的,包涵体经各种溶液洗涤后,用8 mol/L尿素裂解,裂解上清在8 mol/L尿素存在下,经离子交换柱层析和凝胶过滤两步纯化,得到纯度大于95%的γ-干扰素,稀释复性后,其比活为5.5×105 U/mg. 激光解析电离质谱分析表明,中国汉族人源γ-干扰素的分子质量为17.32 ku,其N端序列与Gray等报道的γ-干扰素N端序列一致.中国汉族人源γ-干扰素的氨基酸组成分析结果也与其理论值相吻合.  相似文献
5.
利用5L生物反应器悬浮培养HEK-293N3S细胞生产携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus-greenfluorescent protein,Ad-GFP),为规模化生产腺病毒基因药物建立一种稳定可行的生产工艺。复苏的种子细胞进行逐级放大最后接入5L搅拌式生物反应器中,采用含5%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培基灌流培养293N3S细胞,当细胞密度达到(2~4)×106个/mL时感染Ad-GFP,48h后收获细胞,经两步氯化铯超速离心获得纯化的Ad-GFP。采用紫外分光光度计比色法和高压液相色谱法(HPLC)测定病毒颗粒数和纯度,采用组织培养半数感染剂量(TCID50)法检测腺病毒的感染滴度。连续培养10~12d,细胞密度可达到(2~4)×106个/mL左右,纯化的Ad-GFP感染滴度和颗粒数分别为1.0×1011IU/mL和1.68×1012VP/mL,比活性为6.0%,A260/A280比值为1.33,产品纯度达到99.2%。建立了5L生物反应器悬浮培养293N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的生产工艺,对携带其他基因的重组腺病毒药物生产具有一定的指导意义。  相似文献
6.
目的:pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。为了生产制备重组质粒pUDKH,须建立菌种库并对其进行质量检定。方法:将质粒pUDKH转化大肠杆菌DH5α,经筛选后制备成初始菌种库和工作菌种库,对菌种进行革兰染色、电镜、抗生素抗性、遗传稳定性、质粒拷贝数、生化反应等检定。结果与结论:菌种生产pUDKH的产量较高,无支原体及其他微生物污染,40代次内菌种性状、遗传稳定性、质粒拷贝数均稳定,可作为工艺生产用菌种。  相似文献
7.
利用造血细胞体外琼脂培养技术,比较了狗的不同来源的GM—CFC增殖、分化性能和辐射敏感性。结果表明,在正常生理条件下循环血中GM—CFC集落产率约为骨髓的1/60;细胞集落开始形成时间较骨髓晚1天,细胞集落随培养时间(前3—5天)增加而增加,其增加速率约为骨髓的20%;辐射敏感性D_0值为0.34Gy,明显低于骨髓中GM—CFC的D_0值(0.82Gy)。造血干细胞动员剂动员后血中GM—CFC数量明显增加,细胞集落增加速率约为骨髓的59%,D_0值为0.72Gy。从而为循环血干细胞移植疗效提供了实验依据。  相似文献
8.
重组质粒DNA用于基因治疗需要大量符合药学规格的质粒DNA,发酵是影响质粒产率的关键步骤之一。比较了4种不同的培养基对pcDNA3-HGF产率的影响,其中自配复合培养基(ZP)质粒产率最高,而LB培养基的质粒产率最低,5L发酵罐发酵最终pcDNA3-HGF产率达72mg/L,为大规模发酵生产提供依据。  相似文献
9.
在CFU-C(粒系或单核-巨噬细胞集落生成单位)体外琼脂培养中,只有在CSF(细胞集落生成刺激因子)的作用下粒系祖细胞才能增殖、分化,生长成为细胞集落。CSF来源广泛,其刺激活力文献报告不一。此外,CFU-C产率波动较大,影响因素甚多。本文在相同的实验条件下,比较了不同来源的CSF刺激活力,并对影响CFU-C产率的某些因素进行了分析。  相似文献
10.
EH蛋白是一种水蛭素衍生物,它是在水蛭素的N端引入了一小段寡肽,该寡肽可被凝血因子XIa(factor XIa, FXIa)和Xa(factor Xa,FXa)裂解释放水蛭素的抗凝血酶活性。比较在不同条件下FXa裂解EH蛋白的效果,包括裂解时间(2h,4h,6h,8h,10h,20h)、裂解温度( 25℃,37℃,40℃),FXa与EH蛋白摩尔比(1 ∶300,1 ∶180,1 ∶60),反应溶液(水、生理盐水、裂解缓冲液)。分别采用凝块法和TH生色底物法检测EH蛋白经FXa裂解后的体外抗凝血酶活性。FXa对EH的裂解活性在一定条件下与反应时间和温度成正比,裂解活性随FXa的摩尔数增加而增强。反应溶液对其裂解活性影响较弱,其中生理盐水为最适裂解溶剂。最终确定EH体外活性检测时最适裂解条件为:用生理盐水稀释EH样品,FXa与EH的摩尔比为1 ∶180,在37℃裂解6h。此法裂解EH蛋白,操作方便,所测活性重现性好,适合作为EH蛋白质量控制中活性测定的方法。  相似文献
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