家蚕色氨酸羟化酶(TRH)基因的克隆及表达特性分析（英文）

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是生物界广泛分布的信号分子,涉及动物的重要行为。5-HT是色氨酸羟化酶(Tryptophan hydroxylase, TRH)将L-色氨酸羟化为5-羟-L-色氨酸,5-羟-L-色氨酸随即被多巴脱羧酶(Aromatic L-amino acid decarboxylase, DDC)脱羧而成。TRH作为5-HT合成的限速酶,在无脊椎动物神经调控中具有重要地位。鳞翅目昆虫中TRH的功能研究并不多。在家蚕中克隆了家蚕TRH (Bombyx mori TRH, BmTRH)的cDNA序列1667bp,其中包含1632bp的开放读码框(Openreadingframe,ORF)。人类TPH或者果蝇TRH(Drosophila TRH, DmTRH)与BmTRH有高度相似性,尤其BmTRH和DmTRH之间大多数氨基酸保守说明它们在系统发育上的密切关系并可能有相似功能。基因表达分析显示BmTRH主要表达于头部和中枢神经组织,免疫组织化学和Western blotting结果显示BmTRH只存在于神经组织中,即BmTRH可能仅参与家蚕的神经活动。此外,家蚕DDC(B.moridecarboxylase,BmDDC)和蛋白具有TRH活性的苯丙氨酸羟化酶基因(Phenylalanine hydroxylase, BmPAH)也在中枢神经系统中有表达,暗示家蚕神经系统5-HT的合成与果蝇中不同,可能有两种不同的调控机制。     

家蚕色氨酸羟化酶 (TRH) 基因的克隆及表达特性分析

5-羟色胺 (5-hydroxytryptamine, 5-HT) 是生物界广泛分布的信号分子,涉及动物的重要行为。5-HT是色氨酸羟化酶 (Tryptophan hydroxylase, TRH) 将L-色氨酸羟化为5-羟-L-色氨酸,5-羟-L-色氨酸随即被多巴脱羧酶 (Aromatic L-amino acid decarboxylase, DDC) 脱羧而成。TRH作为5-HT合成的限速酶,在无脊椎动物神经调控中具有重要地位。鳞翅目昆虫中TRH的功能研究并不多。在家蚕中克隆了家蚕TRH (Bombyx mori TRH, BmTRH) 的cDNA序列1 667 bp,其中包含1 632 bp的开放读码框 (Open reading frame, ORF)。人类TPH或者果蝇TRH (Drosophila TRH, DmTRH) 与BmTRH有高度相似性,尤其BmTRH和DmTRH之间大多数氨基酸保守说明它们在系统发育上的密切关系并可能有相似功能。基因表达分析显示BmTRH主要表达于头部和中枢神经组织,免疫组织化学和Western blotting结果显示BmTRH只存在于神经组织中,即BmTRH可能仅参与家蚕的神经活动。此外,家蚕DDC (B. mori decarboxylase, BmDDC) 和蛋白具有TRH活性的苯丙氨酸羟化酶基因 (Phenylalanine hydroxylase, BmPAH) 也在中枢神经系统中有表达,暗示家蚕神经系统5-HT的合成与果蝇中不同,可能有两种不同的调控机制。     

不同桑树品种上朱砂叶螨实验种群内禀增长率的统计推断

为了正确地评价不同桑树品种上朱砂叶螨为害差异,本文通过使用Jackknife方法(刀切法),采用合适的生殖力生命表构建方法,对朱砂叶螨实验种群在不同的4个桑树品种上生殖力表的内禀增长率进行了统计推断。结果表明,温度为28±1℃、相对湿度75%±10%、光周期16L∶8D的条件下,西农6071 (山桑 Morus bombycis Koidz.,2x)、和田白桑 (白桑 M. alba Linne, 3x)、新一之濑 (白桑 M. alba Linne, 2x)和大石(广东桑 M. atropurpurea Roxb., 3x) 4个桑树品种上朱砂叶螨r_m值大小依次为0.41894（0.41043～0.42746）、0.37065（0.36604～0.37526）、0.36171（0.35778～0.36563）和0.35253（0.34757～0.35748）。通过对“伪值”样本同秩的成对t检验比较,这4个桑树品种对朱砂叶螨内禀增长率的影响有显著差异。结果说明朱砂叶螨对4种桑树的易感性,以西农6071、和田白桑、新一之濑、大石顺序渐弱。     

家蚕茧质性状的性别效应预测

研究采用混合线性模型,对家蚕全茧量、茧层量、茧层率和蛹体重等性状的性别效应进行理论估算：全茧量、茧层量、茧层率和蛹体重等4性状的性别随机效应的方差的概率和性别随机效应的预测值概率都达到极显著水平,证明全茧量、茧层量、茧层率和蛹体重等四性状的性别效应极显著,这完全符合实际情况。全茧量、茧层量、茧层率和蛹体重等4性状的性别效应预测值雌（雄）分别为0.248g（-0.247g）、2.423cg(-2.394)cg、-1.976%(1.992%)和0.224g(-0.223g)。性别效应调整后各性状均呈单峰正态分布,符合QTL分析对数量性状连续正态分布的要求。     

家蚕近交系遗传纯度的RAPD检测

目的分析家蚕近交系IS-c108A的遗传纯度,为家蚕实验动物化的培育工作提供指导。方法应用经过筛选的20条随机引物对家蚕近交系IS-c108A(F10)的3个蛾区各30个个体和该近交系的亲本系统c108、对照实用化品种871各30个个体的基因组DNA进行RAPD扩增,计算个体间和蛾区间的相似系数及遗传距离。结果家蚕近交系IS-c108A(F10)的3个蛾区内的多态性带频率分别为1.807%、1.841%、1.841%,平均为1.830%;起点亲本c108个体间多态性带频率为7.207%,对照品种871个体间的多态性带频率为7.08%;而近交系IS-c108A与c108之间的多态性带频率为49.20%,c108和871品种之间的多态性带频率为58.33%。家蚕近交系IS-c108A10的3个蛾区内个体之间遗传相似系数的平均值分别为0.99581、0.99555、0.99551,总平均为0.99562。结论家蚕近交系IS-c108A(F10)已具有较高的遗传纯合度,家蚕具有易于获得高纯的有利条件。     

家蚕线粒体ND2、COⅠ和若干tRNA基因的克隆及序列分析

克隆并测定了家蚕（Bombyx mori）线粒体基因组3468bp的EcoRⅠ和HindⅢ双酶一段序列,根据序列同源性比较,该DNA片段包括3个蛋白质编码基因：ND2基因、COⅠ基因和COⅡ基因5′端399bp的序列,以及6个tRNA基因和一个尚待确定的tRNA^Met基因。家蚕与果蝇的ND2基因序列同源性约69.7%,COⅠ基因的同源性约83.8%,COⅡ基因5′端的同源性约80％,这表明细胞色素氧化酶基因在物种间比烟酰胺腺漂呤二核苷酸脱氢酶基因保守,6个推定的tRNA基因序列与果蝇相应tRNA基因序列差异较大,另外,除tRNA^Chn基因的二级结构相似外,其它tRNA基因的二级结构与果蝇相应tRNA基因的二级结构也有较大差异。     

桑树二倍体及人工诱导的同源四倍体遗传差异的AFLP分析

利用AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)分子标记技术 ,即扩增片段长度多态性 ,从DNA分子水平探讨二倍体桑 (2n =2X =2 8)与经秋水仙素诱变得到的同源四倍体桑 (2n =4X =5 6 )在遗传结构上的差异。根据对供试材料DNA多态性及遗传距离分析 ,认为经秋水仙素诱变得到的同源 4X与 2X相比在DNA分子遗传结构上产生一定程度的改变 ,在种内变异水平上 ,2X与同源 4X桑间的遗传差异小于种间差异。     

家蚕AFLP连锁框架图谱的构建

利用改进的AFLP分子标记方法,对家蚕Bombyx mori回交一代BC1群体进行连锁图谱的构建。经17组AFLP引物的选择性扩增,共得到430个多态位点,卡方检验后有253个为有效位点。利用Mapmaker/Exp (Version 3.0b)软件作连锁分析,其中163个标记分属28个连锁群,连锁群标记数变化范围是2～28个,平均每个连锁群标记数为5.8个,该图覆盖的基因组长度为2.998.9cM(图距单位),连锁群长度变化范围为4.5～652.8 cM,连锁群的平均长度为107.1 cM,平均图距为4.5～36.7 cM。     

cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良

cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一。广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆。但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、TdT加尾、第二链合成、RACE-PCR扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度,主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述。     

黄连ISSR反应条件优化的研究

以黄连(味连,Coptis Chinensis Franch.)基因组DNA为模板,通过单因子、双因子实验研究了ISSR反应体系中主要成分（Mg²⁺、dNTP、引物、模板、Taq DNA聚合酶）以及热循环参数（退火温度、循环数、变性时间、退火时间、延伸时间）对扩增结果的影响,并找出各自的最适条件,建立了适合黄连ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25μL反应体系中,内含1×PCR buffer、1.5mmol·L^-1 Mg²⁺、200μmol·L^-1 dNTP、0.3 μmol·L^-1引物、40 ng模板、1 U TaqDNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环：94℃变性30 s,（据不同引物的退火温度）复性1 min,72℃延伸1.5 min,循环结束后72℃延伸7 min,-4℃保存。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术进行黄连鉴定及种质遗传多样性分析提供了一个标准化程序。