SARS冠状病毒感染Lewis大鼠模型的建立

目的通过观察SARS-CoV感染Lewis大鼠后,病理学、免疫学以及病毒的复制与外排情况变化,探讨其能否作为有效的SARS动物模型。方法SARS病毒感染9只Lewis大鼠,在感染后不同时间安乐死动物,应用光镜对动物的各脏器进行病理观察研究;用病毒分离和RT-PCR方法检测病毒外排与复制的情况;用ELISA法检测动物产生特异性抗体情况。结果在SARS-CoV感染Lewis大鼠后,肺组织出现一定的与人类SARS疾病相似的病理改变,在动物体内可检测到活病毒或病毒核酸,并可检测到特异性IgG抗体的存在。结论Lewis大鼠出现了特异的免疫反应及特征性病理改变,可做为灵长类SARS动物模型的有益补充用于SARS发病机理及疫苗的研发等。     

无菌APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠模型建立及脑内斑块变化初步观察

目的 使用剖宫产净化方法建立无菌APPswe/PS1ΔE9(PAP)双转基因小鼠模型并对动物脑内斑块沉积情况进行初步观察,为研究肠道菌群与阿尔茨海默症关系提供新的动物模型。方法 选择阳性PAP雄性杂合子鼠与经产的C57野生型雌鼠1∶2进行交配。怀孕母鼠在超净工作台内行剖宫产手术,用无菌ICR小鼠代乳。术后每个月进行无菌状态检测;PCR方法检测剖宫产所得PAP仔鼠的基因型;免疫组化方法定量检测9月龄PAP小鼠脑内斑块变化情况。结果 实施剖宫产手术12例,获仔鼠66只,剖宫产存活率及离乳存活率分别为95.45%(63/66)和95.24%(60/63),净化后按国标检测无菌状态均为合格。免疫组化结果显示9月龄无菌PAP小鼠海马内斑块较同月龄SPF级动物减少。结论 通过剖宫产净化技术去除了PAP小鼠携带的菌群,9月龄无菌PAP小鼠脑内斑块减少。     

建立H5N1流感病毒感染雪貂动物模型

目的建立甲型H5N1流感病毒感染雪貂动物模型[1-3]。方法 H5N1流感病毒株A/Vietnam/1203/2004病毒以103和104 TCID50滴度分别感染雪貂。对4～10月龄去势雪貂经兽用氯胺酮轻度麻醉后进行滴鼻感染,每个稀释度接种3只雪貂,感染后第5天安乐处死。感染后每天记录雪貂一般临床变化。感染前0 d采集鼻甲骨活检,感染后1～5 d鼻甲骨活检检测病毒载量和病毒滴度。处死时取雪貂气管、肺、心、肝、脾、肾、小肠、脑组织作病毒滴度检测和病理检查。结果 H5N1103和104 TCID50的病毒分别感染雪貂,雪貂死亡都率在33%。103TCID50和104 TCID50病毒分别感染雪貂,动物都出现持续3 d体温升高,104 TCID50组出现超过20%的体重下降。上呼吸道排毒呈现上升趋势,并可在除呼吸系统以外的组织器官中分离到病毒。感染的雪貂病理表现为重度肺炎。结论雪貂感染H5N1病毒株后在临床表现、病毒学、分子生物学、病理学方面的检测都可以证实雪貂感染H5N1病毒动物模型已建立,104 TCID50病毒滴度是一个建立感染动物模型比较合适的剂量。     

结核分枝杆菌感染小鼠的脾脏和肺脏组织荷菌量与病理变化

目的分析结核急性感染小鼠脾脏和肺脏的组织荷菌量以及病理的动态变化。方法以3×105CFU结核分枝杆菌标准株H37Rv尾静脉途径感染雌性C57BL/6J小鼠,测定感染后1 d、1周、2周、3周、4周、6周和8周肺脏及脾脏组织的荷菌量,脾脏和肺脏组织经HE染色分析病理变化。结果感染动物的脾脏荷菌量在前3周逐步提高,在4～8周脾脏荷菌量维持稳定,肺脏组织在2～8周组织荷菌量逐步升高。病理分析显示动物感染3周后肺脏和脾脏出现肉芽肿,在6～8周病理损伤加重。结论小鼠经尾静脉感染高剂量结核分枝杆菌在8周前表现为急性感染状态,适用于抗结核药物的体内药效学评价。     

miR-106b在阿尔茨海默病中的作用机制

目的 探讨miR-106b在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)发病中的作用.方法 取3月龄和6月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织,进行microRNA芯片的检测;利用real-time PCR检测3、6、9月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织中miR-106b的表达,对芯片检测结果进行验证;通过构建miR-106b稳定转染细胞系和miR-106b knockdown研究miR-106b与TGFBR2表达之间的关系; 构建TGFBR2 3'UTR-荧光素酶报告载体,验证miR-106b是否可以直接调控TGFBR2蛋白的表达;采用Western blot的方法检测APPswe/ΔPSΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中TGFBR2蛋白的表达情况.结果 miR-106b在3月龄和6月龄AD模型小鼠脑组织中表达升高,在9月龄模型小鼠脑组织中表达降低;通过体外实验,我们发现miR-106b与TGFBR2蛋白的表达呈负相关;荧光素酶报告实验表明TGFBR2 3'UTR序列中包含miR-106b的结合位点;TGFBR2蛋白在3、6、9、12月龄AD模型小鼠脑组织中表达均降低.结论 miR-106b可能通过调控TGFBR2蛋白的表达影响TGF-β信号通路,从而参与AD的发病.     

Dkk3心脏特异表达转基因小鼠心脏功能分析

目的建立心脏特异表达Dkk3转基因模型小鼠,研究Dkk3对心脏发育及和心肌病的调节作用。方法把Dkk3基因插入心肌特异启动子-αMHC下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J Dkk3转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型,采用Northern blot检测Dkk3在心脏组织中的表达,HE染色和超声检查转基因小鼠心脏结构和功能。结果建立了3个不同表达水平的Dkk3转基因小鼠品系。转入的Dkk3基因在心脏组织的表达水平均高于同龄对照小鼠。组织学分析显示Dkk3小鼠室壁变厚,心腔减小,心肌细胞排列轻度紊乱。超声检查显示心室壁变厚,收缩期容积和舒张期容积显著减小,射血分数,短轴缩短率增加。结论Dkk3过表达导致转基因小鼠室壁变厚,心腔减小,心肌细胞排列轻度紊乱,心肌舒张功能轻度失调。     

海南省及云南西双版纳州HIV-1的分子流行病学比较研究

目的调查比较HIV-1在海南省及云南西双版纳州的流行情况及分子流行病学分析高危因素传播的情况以及传播链的鉴定。方法我们与海南省CDC及西双版纳州CDC合作在其境内开展了HIV血清学调查,筛查了海南省（1991～2006）及西双版纳州（1996～2005）高危人群志愿者血清样本。在本次两地调查中,我们通过系统进化分析方法,对已诊断的HIV感染者进行分子流行病学的追踪,来分析其中的主要流行亚群以及结合个案追踪进行传播链的鉴定。结果我们共筛查了海南省499725人,共检出HIV阳性感染者523例（0.1%）,以注射器吸毒感染为主要传播途径（经共用注射器吸毒感染占69．2％、经性接触传播占19．3％、供血和使用血液／血液制品感染占3．3％、母婴传播占0．8％、不详占7．7％）。然而,在西双版纳州筛查中发现了较海南省高20倍的检出率：在25390受检人中,共检出HIV阳性感染者501例（2％）并以异性性传播为主（经异性性接触传播占77．3％、经共用注射器吸毒感染占21．1％、经同性性接触传播占0．4％、母婴传播占1．2％）。在海南省抽样的83人中,以CRF01_-AE重组亚型（70人,84．3％）为主要病毒亚型,其他病毒亚型包括B’亚型（8人）、C亚型（2人）、CRF08_BC重组亚型（1人）、B亚型（1人）和1个未报道过的CRF01～AE／B’重组亚型。同样,在版纳抽样的44人中,也以CRF01_AE重组亚型（27人,61．3％）为主要病毒亚型,其他病毒亚型包括CRF08_BC重组亚型（15人）、G亚型（1人）、和1个未报道过的B／C重组亚型。在海南省抽样中有66人（79．5％）分布于4个大小不同的传播群,传播群1（59人）较大（奠基效应）,属于CRF01_AE重组亚型,传播群2、3、4则较小,分别为3、2、2人,分别属于CRF01_AE重组亚型、C亚型和B’亚型。相反,在版纳抽样中有18人（40．9％）分布于8个较小的传播群（每群平均含2．25感染个体）。在海南省抽样中怀疑的6对异性性接触的传播链中,经系统进化分析方法确认了其中的4对,2对被拒绝。在版纳抽样中怀疑的8对异性性接触的传播链中,经系统进化分析方法确认了其中的5对,2对被拒绝,1对无法分析,此外还新发现了3对异性性接触传播群。结论HIV-1感染者的分子流行病学的追踪和分析对于追溯艾滋病流行的源头和地区性预防策略的制定有着重大的意义。     

鼠疫菌cAMP受体蛋白对毒力相关基因yopD调控的初步研究

目的研究鼠疫菌cAMP受体蛋白（CRP）对毒力相关基因yopD的调控情况。方法利用芯片表达谱和实时定量RT-PCR初步判断CRP对yopD的调控,在获得纯化的his-CRP蛋白后进行体外凝胶阻滞实验（EMSA）证明CRP能否直接结合yopD启动子区,DNase I足迹实验（DNase I footprinting assay）确定yopD启动子区CRP结合位点序列精确序列。结果芯片表达谱和实时定量RT-PCR实验一致证实CRP可能直接负调控yopD,EMSA证明CRP能直接结合yopD启动子区,DNase I足迹实验确定yopD的启动子区上CRP位点的精确序列。结论CRP可能直接负调控毒力相关基因仰D。     

心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用。方法Western blot检测小鼠NOL3表达谱。构建aMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠。PCR鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型。结果NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变。通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加。单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化。结论成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。     

阿尔茨海默病中mir-34a作用机制的探讨

目的探讨mir-34a在阿尔茨海默病发病机制中的作用。方法取3月龄和6月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织,进行microRNA芯片的检测;利用real-time RT-PCR对芯片结果进行验证;采用western blot的方法检测APPswe/PSΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中bcl2蛋白的表达情况;通过构建mir-34a稳定转染细胞系和mir-34aknockdown研究mir-34a与bcl2之间的关系;通过构建bcl23’UTR-荧光素酶报告载体,验证bcl23’UTR序列中包含mir-34a的结合位点。结果mir-34a在模型小鼠中表达水平明显升高,并且其表达水平与bcl2蛋白水平呈负相关;通过体外实验,我们发现mir-34a过表达可以明显降低bcl2蛋白水平,反之,当我们抑制mir-34a的表达以后则可以增加bcl2蛋白水平;荧光素酶报告载体实验表明bcl23’UTR序列中包含mir-34a的结合位点。结论bcl2可能是mir-34a重要的功能靶点,mir-34a的过表达可能通过下调bcl2的蛋白水平,从而参与AD的发生。