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牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染 总被引:1,自引:0,他引:1
为获得转基因克隆牛的供体细胞,采用组织块贴附培养的方法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,经2~3次传代纯化,绘制生长曲线,分别分析体外传代培养10代以内和20代以上细胞的核型特征。分别采用800、900、1000V/cm和1、5、10、15和20ms的参数组合,将线性化的带有新霉素抗性和绿色荧光蛋白双重筛选标记的人胰岛素原乳腺特异表达载体pNEI电穿孔转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,经800μg/mLG418筛选2周,继续以300μg/mLG418扩大培养2~3代,取部分筛选后的细胞进行PCR检测结果表明,体外培养的牛胎儿成纤维细胞生长旺盛,体外传代20次后核型未发生改变;转染后24~48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光表达,筛选后各组克隆形成数以900V/cm和5ms组最多;PCR检测得到了预期条带,说明目的基因已经成功导入。分离得到的牛胎儿耳成纤维细胞有可能作为体细胞核移植的供体,进行转基因克隆研究。 相似文献
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曲古抑菌素A对体外培养牛成纤维细胞组蛋白乙酰化和甲基化的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
Trichostatin A(TSA)是一种特异的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。研究显示,TSA可以特异地抑制组蛋白去乙酰化酶活性,提高细胞的组蛋白乙酰化水平,激活基因的表达。但是,目前还不是很清楚TSA处理是否对组蛋白甲基化产生影响。本研究以成纤维细胞为研究对象,利用免疫细胞化学技术及激光共聚焦显微镜,探讨了TSA处理体细胞对其组蛋白乙酰化及甲基化修饰的影响。结果显示,随TSA浓度增加,体细胞形态发生明显的改变,细胞变得扁平且核区较大,处理后组蛋白H4K8位点的乙酰化水平随着TSA浓度的增加明显提高。检测组蛋白H3上两个甲基化位点发现,随组蛋白乙酰化水平的增加,H3K4位点的三甲基化(H3K4me3)水平也显著提高。但是,对于H3K9的二甲基化水平(H3K9me2)则没有明显变化。以上结果显示,TSA的处理不仅可以提高体细胞的组蛋白乙酰化水平,同时也增加了与基因表达激活相关组蛋白修饰位点的甲基化水平,但是对于与沉默基因相关的组蛋白修饰位点则没有明显的影响。 相似文献
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小鼠-牛体细胞种间核移植 总被引:1,自引:0,他引:1
本文探讨了小鼠-牛异质胚构建的简便方法及小鼠体细胞核在牛卵母细胞中重新编程的可能性。以牛的卵母细胞为细胞质供体,用去除透明带及徒手切割的方法去核,设定电压1.5 KV/cm,脉冲时间40μsec,与小鼠皮肤成纤维细胞进行电融合的融合率为67.44%,卵裂率为30.23%。融合细胞经离子酶素-6-DMAP激活,用微滴内压制做窝的方法培养小鼠皮肤成纤维细胞异质胚,异质胚的最终发育阶段为8细胞期。结果表明,去透明带牛卵母细胞经切割法去核,可用于小鼠异质胚构建;微滴内做窝的体外培养方法可避免无透明带胚胎的聚合。 相似文献
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有假说认为,卵母细胞在体外培养过程中,如果延长GV期,可促进卵母细胞进一步成熟,因而提高发育潜能。采用山羊半卵泡和卵母细胞共培养,抑制卵母细胞GVBD发生,从而延长GV期。比较了共培养前后和恢复成熟培养后卵母细胞的超微结构变化,其目的从亚细胞水平寻找卵母细胞进一步成熟的证据。研究发现,常规成熟培养:有卵周隙存在,但不贯通,局部区域卵膜与透明带结合紧密;部分皮质区尚有细胞器存在;微绒毛大部分从透明带中撤出,倒伏于质膜表面,数量较多,形态较为粗大;皮层颗粒质膜下部分单层分布,部分散布于皮质区;线粒体均匀散布于卵质中央区。共培养前:卵母细胞的卵周隙尚未形成,微绒毛没有从透明带中撤出;线粒体等细胞器分布于皮质区,皮层颗粒成簇状分布,皮质区富含细胞器。共培养后:局部形成卵周隙,微绒毛已自透明带中撤出,数量较多,垂直或倒伏于卵膜表面;线粒体以簇状分批开始内移,皮层颗粒已部分单层分布于质膜下,部分皮质区缺乏细胞器。恢复成熟培养后:卵周隙进一步扩大并且贯通,微绒毛数量减少并且绝大多数垂直于卵膜;线粒体在卵质中央区均匀分布,皮层颗粒卵膜下单层分布,大部分皮质区无细胞器存在。利用“两步法”培养得到的卵母细胞与体外常规成熟培养的卵母细胞相比,更有利于皮层颗粒的质膜下单层分布,卵母细胞卵周隙的形成与贯通,微绒毛数量减少和垂直于卵膜表面,无细胞器皮层区的进一步形成。因此,更有利于卵母细胞胞质的进一步成熟。 相似文献
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雌牛生殖道内游离氨基酸种类及含量分析 总被引:1,自引:0,他引:1
根据黄体的大小和形态,判断屠宰母牛的发情时期,分别收集发情第3天(D3)和第7天(D7)的输卵管液(OF)和子宫液(UF),通过HPLC分析游离氨基酸种类及含量。总共检测到23种氨基酸,包括除Cys外的19种必需和非必需氨基酸,以及另外四种(βAla,Tau,Orm和Cit)非蛋白质氨基酸。OFD3、UFD3、OFD7和UFD7的游离氨基酸总量分别为31.6、46.9、26.3和17.2mmol/L,其中,Gly含量最高,分别为14.7、14.4、11.1和4.4,其次为Glu、Gln和A1a,其他氨基酸的含量均接近或低于lmmol/L。结果表明:氨基酸总量及个别氨基酸含量在不同体液及不同发育时期均存在一定程度的差异. 相似文献
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绒山羊表达红色荧光及转胰岛素样生长因子Ⅰ基因体细胞核移植胚胎的制备 总被引:1,自引:0,他引:1
利用含有红色荧光和Neor基因双选择标记的IGF1毛囊特异表达载体pCDsR-KI转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得具有红色荧光的IGF1转基因细胞.核移植操作前,通过比较卵母细胞体外成熟培养不同时间的成熟率以及核与极体的距离,确定20h为绒山羊卵母细胞的最佳成熟时间.比较了不同激活方法和培养体系对孤雌胚激活效率和孤雌胚早期发育的影响,结果表明:IA23187+6-DMAP组的激活效率和囊胚率(88.7%&21.6%)均稍高于乙醇+6-DMAP组(86.4%&20.4%),但二组相应数据之间差异均不显著(P〉0.05),选择前者作为转基因核移植胚的激活方案;SOFaa和CR1aa两种体外培养体系中,孤雌胚卵裂率(86.8%vs83.9%)和囊胚率(23.1%vs17.2%)均差异不显著(P〉0.05),选择结果较好的SOFaa组.比较了不同电融合参数的融合效果,结果表明:190V/mm处理组结果(62.4%)显著高于130V/mm(32.8%)和200V/mm(42.9%)组(P〈0.05).通过T-SCNT获得转基因重构胚胎203枚,48h卵裂率为79.3%(161/203),第7~9天囊胚发育率为15.3%(31/203).所得到的31枚囊胚中,较强表达红色荧光蛋白的囊胚数为17枚(阳性率为54.8%).随机挑选两枚红色荧光囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为转基因阳性.以上结果显示:(i)表达载体的红色荧光蛋白和Neor基因可以正常表达可获取转基因细胞和阳性转基因胚胎;(ii)所制备转基因囊胚仍有部分不表达红色荧光蛋白,说明即使选择转基因阳性细胞进行核移植所得囊胚也并非全部为转基因阳性,在囊胚期进一步筛选是必要的;(iii)通过TSCNT操作及优化,成功获得了表达红色荧光并同时转有IGF1基因的绒山羊胚胎,为绒山羊的转基因研究提供基础数据. 相似文献
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