五种假单胞菌的分离鉴定及其生物活性

【目的】从湖南长沙市采集到的土样中分离假单胞菌并进行归类,研究各菌株抑菌和抗肿瘤生物活性,以丰富假单胞菌菌种资源并为微生物次级代谢物的挖掘奠定基础。【方法】采用大蜡螟诱集法诱集分离假单胞菌,结合形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性分析,鉴定并归类各细菌,通过平板扩散法、对峙培养法和肿瘤细胞毒性试验分别研究各菌株抑制细菌、拮抗真菌和抗肿瘤细胞等生物活性。【结果】从湖南长沙市郊区菜地、林地中分离得到5株假单胞菌,归类并命名为Pseudomonas protegens CY01、绿针假单胞菌CY02(Pseudomonas chlororaphis CY02)、栖稻假单胞菌CY04(Pseudomonas oryzihabitans CY04)、Pseudomonas sp.CY05和恶臭假单胞菌CY06(Pseudomonas putida CY06)。P.protegens CY01和P.chlororaphis CY02对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有较好的抑菌效果,P.chlororaphis CY02对水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)具有良好的拮抗作用,对小鼠黑色素瘤细胞B16具有较强的细胞毒性。【结论】分离得到的P.chlororaphis CY02,在抑制病原细菌、拮抗水稻稻瘟病菌和抗肿瘤细胞等方面具有显著效果。     

不同碳源对须糖多孢菌生长发育及丁烯基多杀菌素生物合成的影响

本文研究了不同碳源对须糖多孢菌生长以及丁烯基多杀菌素生物合成的影响,通过寻找优势碳源优化发酵培养基配方,促进须糖多孢菌丁烯基多杀菌素的生物合成。试验共设11个处理,1个对照,通过单因素试验比较不同处理组菌体OD600值和丁烯基多杀菌素产量,筛选获得最优碳源及其发酵培养基配方。结果表明,除可溶性淀粉和木糖外,须糖多孢菌在9种碳源中都能进行生长,对不同构型碳源显示较好的利用率。在以半乳糖、葡萄糖、果糖和甘露糖作为碳源时具有较好的生长速率,而以甘露糖为碳源时能显著促进丁烯基多杀菌素的合成。选择甘露糖最佳添加浓度为5 g/L,须糖多孢菌最高菌体浓度和丁烯基多杀菌素产量分别是初始配方条件的1. 32倍和1. 78倍,显著提高了丁烯基多杀菌素的产量。上述结果为培养基碳源对丁烯基多杀菌素生物合成影响机制的研究及丁烯基多杀菌素大规模工业化发酵生产提供了科学依据和新的技术途径。     

sTRAIL蛋白原核表达载体的构建、表达及抗肿瘤活性研究

目的:从HL-60细胞中获得了sTrail基因片段,优化蛋白表达条件,并研究其抗肿瘤活性。方法:培养HL-60细胞,提取总RNA,通过RT-PCR扩增sTRAIL蛋白基因片段,并将目的基因克隆至原核表达载体p ET28a上,并电击转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化蛋白表达条件,Ni-IDA柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE蛋白电泳,胶内酶解质谱鉴定。纯化后的重组蛋白作用HUVEC,He La,Hep-3B,HCT-116,MDA-MB-231,H460细胞检测蛋白生物学作用。结果:DNA测序结果证实成功构建了重组质粒p ET28a-sTrail,SDS-PAGE蛋白电泳,胶内酶解质谱检测显示成功表达sTRAIL蛋白,MTT法和流式细胞术结果显示,sTRAIL蛋白对肿瘤细胞包括He La,HCT-116,MDA-MB-231,H460,Hep-3B细胞有良好的生物活性,对正常的HUVEC细胞无毒性。结论:成功构建可以高效表达sTRAIL蛋白的原核表达载体,优化蛋白的表达和纯化后所得sTRAIL蛋白具有良好的抗肿瘤生物活性,为研究和发展利用sTRAIL蛋白作为临床治疗抗肿瘤药物提供了重要基础。     

苏云金杆菌4.0718菌株杀虫晶体65kD原毒素的质谱分析

以苏云金杆菌4.0718菌株杀虫晶体65kD原毒素为材料,探索了从SDS－PAGE胶上回收蛋白质进行质谱分析的方法。蛋白纯化的步骤包括SDS－PAGE、电洗脱、脱盐、除SDS。电洗脱采用半透膜法,用超滤法脱盐,冷丙酮沉淀法除去SDS。结果表明,纯化的65kD原毒素经ESI－MS检测,分子量约64500Da。经MALDI－MS检测,未能有明显蛋白峰出现,这可能是该蛋白由于较强的疏水作用,溶解性差,在与基质混合时处于聚和悬浮态所致。     

新型冠状病毒SARS-CoV-2研究进展

在武汉发生的由新型冠状病毒SARS-CoV-2引发的人类冠状病毒病COVID-19,仅仅2个多月时间在我国及国际上70多个国家出现迅速传播,致病和死亡率高,人类生命受到了极大威胁。一些科学家火速投入研究,对SARS-CoV-2的来源和进化、形态特征和基因结构、感染和致病分子机制开展深入研究,取得了重大进展,为科学防控COVID-19提供了重要依据。根据上述研究的基础,文中对COVID-19病毒疫苗、抗体和抑制剂研发提出了设想,在研究防控COVID-19核心技术上具有一定的参考价值。     

三种淡水鱼类在中国南北两个地区的肠道菌群差异比较

山东省德州市禹城市和湖南省长沙市望城区分别属于我国北方和南方地区,环境和气候差异明显。本试验以禹城市和望城区两地的草鱼(Ctenopharyngodon idella)、鲫鱼(Carassius auratus)和鲤鱼(Cyprinus carpio)为研究对象,对肠道中的菌群进行16s rRNA V4高变区扩增,基于IonS5 TM XL测序平台进行测序,并对相关数据进行分析。结果表明,在门水平上鲫鱼、鲤鱼、草鱼的肠道优势菌主要为变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes),各组中这四种菌门所占比之和均在80%以上;基于Bray-Curtis距离值的秩次进行组间差异显著性检验,山东草鱼组和湖南草鱼组比较中组间差异大于组内差异(R=0.307,P<0.05),且线性判别分析显示湖南草鱼组的特征性菌群为弧菌属,而山东草鱼组的为梭菌纲,推测特征性菌群差异与环境的影响有关;有害菌种的统计分析表明,湖南鲫鱼组和鲤鱼组的嗜水气单胞菌属相对丰度明显高于对应的山东鲫鱼组和鲤鱼组,山东草鱼组和鲤鱼组的弧菌属相对丰度高于对应的湖南草鱼组和鲤鱼组,可能受外界环境的影响,不同地区抵御外来有害细菌的能力也不一样。本研究对两地的淡水鱼类肠道微生物群落结构进行了比较和分析,为进一步的鱼类发育研究奠定基础。     

脂肪酶lipAB操纵子在防御假单胞菌中的克隆、表达及活性研究

对荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderia glumae PG1)基因组中的脂肪酶操纵子lipAB片段进行直接克隆,构建含有脂肪酶基因的分泌表达载体,实现其在防御假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)中的异源表达,并研究重组工程菌的胞外脂肪酶活性。利用Red/ET直接克隆技术获得克隆载体p15A-cm-lipAB;再通过亚克隆技术构建重组表达载体pBBR1-km-lipAB和pBBR1-km-Papra-lipAB,将这两个表达载体分别电转至Pf-5中,通过卡那霉素或者阿伯拉霉素抗性筛选得到转化子,以三丁酸甘油酯平板扩散法和对硝基苯酚法检测脂肪酶酶活,并通过实时荧光定量PCR检测启动子的替换对lipA表达的影响。本研究从PG1中成功克隆了脂肪酶操纵子lipAB(GenBank accession number:AJK49931. 1 and AJK49932. 1);成功构建了重组工程菌Pf-5/pBBR1-km-lipAB和Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB,并成功检测到两株工程菌的胞外脂肪酶活性;以LB培养基培养至24 h时,启动子优化后lipA基因表达量是原始水平的2. 1倍;在LB培养基摇瓶发酵至66 h时,Pf-5/pBBR1-km-lipAB的脂肪酶酶活最高且为13. 51 U/mL,而Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB的酶活为46. 85 U/mL,是Pf-5/pBBR1-km-lipAB的3. 47倍。初步实现基因lipA在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Papra比lipAB的原始启动子PlipAB效率更高,为将来实现规模化生产奠定了技术基础。     

发光杆菌TT01中Tc毒素复合体基因簇的直接克隆

本研究通过NCBI数据分析得知Photorhabdus luminescens TT01基因组中表达Tc毒素蛋白复合体的基因簇包含了6个相关的Tc毒素基因,分别为tcaZCB(plu0514-0515)、tccAB3(plu0805-0806)、tccAB1(plu4165-4169)、tcd(plu0960-0971)、tccC4(plu0976)和tccC7(plu4488)。利用Red/ET直接克隆技术,快速获得发光杆菌TT01基因组DNA上的4个Tc毒素基因tcaZCB(6 804 bp)、tccAB3(7 419 bp)、tccAB1(10 954 bp)和tcd(51 406 bp)分别构建到相应的重组质粒p15A-cm-tcaZCB、p15A-cm-tccAB3、p15A-cm-tccAB1和p15A-cm-tcd上。通过PCR技术分别扩增得到tccC4基因(2 891 bp)和tccC7基因(2 871 bp),并进行T载体连接后,分别获得质粒pMD18-tcc4和pMD18-tcc7。本研究通过两种不同的生物技术方法成功克隆到发光杆菌TT01基因组上的Tc毒素蛋白复合体的所有相关基因,为后续的研究打下一定的基础。     

利用转座子构建靶向侵袭性抗肿瘤工程菌

转座子是一类在基因组上可以自由跳跃的移动序列,同时也是对微生物进行基因修饰和插入突变的有效工具,但尚未见有利用转座子导入革兰氏阴性菌E.coli Nissle1917菌株的报道.本研究通过构建p R6K转座载体,对肠道益生菌E.coli Nissle1917菌株进行了转座插入诱变,将假结核耶尔森菌的侵袭素基因inv和单核细胞增多性李斯特菌的溶血素基因hly随机整合至E.coli Nissle1917菌株的染色体上,从而使非致病性大肠杆菌E.coli Nissle1917获得侵袭哺乳动物细胞的能力.通过细胞体外侵袭实验发现,本研究所构建的工程菌对B16,HCT-116等肿瘤细胞有较好的侵袭活性,同时与抗肿瘤蛋白Azurin一起作用B16细胞,抗肿瘤效果显著增强,为进一步运用以大肠杆菌E.coli Nissle1917作为DNA疫苗或者基因治疗的载体开辟了新的技术途径.     

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究

已经证实苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)伴孢晶体结合 2 0kbDNA ,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明。研究了选择性溶解Bt 4.0718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体 ,从中抽提出与其结合的 20kbDNA。经NdeⅠ酶切消化后亚克隆构建文库 ,通过PCR-RFLP及测序筛选出含cry1Ac基因的转化子。然后设计引物PCR扩增出cry1Ac基因的ORF并与pET30a连接 ,转化E .coliBL21(DE3) ,高效表达了14.1kD蛋白。表达蛋白占总蛋白量的50%以上 ,且 90 %以上以包涵体形式存在。利用穿梭载体pHT30.4构建表达质粒pHTX42 ,电转化Bt无晶体突变株XBU001,获得重组菌株HTX42 ,经SDS-PAGE分析 ,cry1Ac基因得到强表达 ,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的79.28% ,且其在细胞中累积达细胞干重的6.413% ,比文献报道的25%左右高了 1倍以上。原子力显微镜 (AtomicForceMicroscopy ,AFM)检测显示 ,目的基因在大肠杆菌(E.coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小,而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体,大小约为1.2μm×2.0μm.生测结果显示,包涵体与晶体对小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫均有高效杀虫活性。本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中20kb DNA分子的来源,结构和功能奠定了重要的基础。