miR-34c逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DOX耐药性的研究

miR-34在肿瘤发生发展中起着至关重要的作用,然而,mi R-34在肿瘤耐药中的作用研究不多。该研究将合成的mi R-34c成熟序列转染乳腺癌阿霉素(doxorubicin,DOX)耐药细胞MCF-7/DOX,探讨mi R-34c体外逆转MCF-7/DOX细胞耐药性作用及其可能的机制。采用Real-time RT-PCR检测mi R-34c在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DOX中的表达,MTS法检测miR-34c对MCF-7/DOX细胞阿霉素耐药性的影响,流式细胞术检测miR-34c对MCF-7/DOX细胞周期和凋亡的影响,Real-time RT-PCR和Western blot法检测多药耐药相关蛋白MDR、MRP以及细胞周期与凋亡相关蛋白Bcl-2、E2F3的表达。结果显示,mi R-34c在乳腺癌MCF-7/DOX耐药细胞中低表达,转染mi R-34c可明显增加耐药细胞对阿霉素的敏感性;流式分析发现,miR-34c可以促进耐药细胞G2期细胞周期阻滞和凋亡;与对照组相比较,miR-34c转染组细胞MDR、MRP蛋白表达无明显变化,而Bcl-2、E2F3 mRNA和蛋白表达均明显下调。研究表明,miR-34c直接靶向抑制Bcl-2和E2F3的表达,诱导细胞周期G2期阻滞和凋亡,进而增强MCF-7/DOX耐药细胞对阿霉素的敏感性。     

基于20 cm蒸发皿蒸发量制定的华北地区温室黄瓜滴灌灌水制度

试验分别于2013和2014年在中国农业科学院新乡综合试验基地进行,以20 cm蒸发皿蒸发量（E_p -20）为灌水依据,设置5种水面蒸发系数（K_cp1:0.25;K_cp2:0.5;K_cp3:0.75;K_cp4:1.0;K_cp5:1.25）代表5种灌水水平,分析了不同水量（I_r）对温室黄瓜滴灌耗水量（ET）、产量、品质以及水分利用效率（WUE）的影响,探讨了以E_p -20制定温室滴灌灌水计划的可行性.结果表明：温室滴灌黄瓜整个生育期内的耗水量在129~314 mm,耗水量随着灌水量的增加而增加.当灌水量超过0.75E_p 20时,各处理之间的产量无差异,平均单果质量、单株瓜条数和平均瓜长对灌水量的响应均存在一个阈值（0.75E_p 20）;品质方面,可溶性固形物、维生素C和可溶性糖含量均随着灌水量的增加而降低,而可溶性蛋白质含量为：K_cp2＞K_cp3＞K_cp4＞K_cp1＞K_cp5;采用修正后的Penman Monteith公式计算温室滴灌黄瓜参考蒸发蒸腾量所得结果与E_p -20呈极显著线性相关关系.可见,在华北地区日光温室黄瓜的滴灌灌水制度选用0.75倍的20 cm蒸发皿水面蒸发量作为灌水依据简单可行.     

黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化

黑曲霉是柠檬酸工业化生产的主要发酵菌株。尽管现代遗传操作技术在黑曲霉的实验室菌株、蛋白质生产菌株等的应用中获得了成功,但是柠檬酸工业菌株遗传转化异常困难,成为柠檬酸工业持续升级的重要限制因素。以柠檬酸工业生产实际应用的黑曲霉菌株为研究对象,对其原生质体的制备与再生以及PEG介导的转化等条件进行了细致优化。结果表明,柠檬酸高产工业菌株原生质体的制备需选取丰富培养基中培养48 h的年轻菌丝体,在1.5%裂解酶-0.5%蜗牛酶-0.2%溶菌酶的复合酶解体系下裂解2.5 h,原生质体的制备浓度可达106个/m L以上,原生质体再生效率可达90%以上。原生质体的浓度是原生质体-PEG介导转化方法的关键,当原生质体浓度达到106个/m L以上时,高产柠檬酸菌株的转化效率大幅提高。成功建立了由原生质体-PEG所介导的高产柠檬酸黑曲霉菌株的遗传转化体系。     

SHIV-XJ02170感染恒河猴后期的传代特点和env基因变异

目的研究SHIV-XJ02170在中国恒河猴感染后期传代过程中病毒和宿主的变化特点,并分析env基因的序列变异。方法将感染中国恒河猴G0401V后期（5年）的SHIV-XJ02170病毒垂直传代2只猴（G0401V→G0402V→0403V）,同时,剔除G0401V猴CD8＋T细胞使潜伏的病毒大量复制后传代1只猴（G0401V→G0404V）,应用流式细胞术、病毒载量测定、序列分析等方法研究该病毒在猴体内长期适应后的病毒和免疫学指标及序列变异特点。结果 G0401V在感染后期仍能稳定传代,且表现出毒力增强的特点。其传代猴G0402V在传代后41 d死亡,外周血CD4＋T淋巴细胞衰竭,仅为43个/mL,符合艾滋病感染猴快速进展型的特征。剔除体内CD8＋T细胞之后的传代猴G0404V的表现类似G0401V,即长期低水平的病毒血症水平。env基因序列分析发现SHIV-XJ02170在G0401V体内长期适应后发生了可遗传的序列变异,并引起糖基化位点的改变。结论 SHIV-XJ02170在猴体长期适应后的传代过程中表现出向强毒株过渡的特征,为进行SHIV-XJ02170感染性克隆的构建奠定了良好的实验基础。     

SHIV1157ipd3N4细胞适应株的制备及其生物特性

目的体外制备SHIV1157ipd3N4病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性。方法用SHIV1157ipd3N4病毒阴道感染中国恒河猴,在血浆病毒载量高峰期采血分离外周血单核淋巴细胞（PBMCs）,与正常中国恒河猴PBMCs共培养。定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50。静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV1157ipd3N4在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性。结果本研究共制备了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液,gp120序列分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。病毒载量为1.586×108 copies/mL,P24抗原水平为1.16×103 pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL。1 mL SHIV1157ipd3N4静脉成功感染中国恒河猴G1004V,高峰期病毒载量达到1.0×106 copies/mL以上。结论此次制备的SHIV1157ipd3N4细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIV1157ipd3N4/中国恒河猴模型。     

N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的表达及免疫原性的影响

目的：研究N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗体外蛋白表达及小鼠体内体液免疫及细胞免疫应答的影响。方法：通过基因工程中定点突变技术,将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白（MHBs）中第4位氨基酸上连接的糖链去除,或将糖链依次移位至第5、6或7位氨基酸,来构建N-糖基化去除及移位的核酸疫苗,分别命名为Adr—dN4、Adr-N4—5、Adr—N4．6、Adr—N4．7。用上述核酸疫苗与野生型MHBs核酸疫苗（pSW3891／MHBs／Adr,简称Adr）及空载体质粒pSW3891分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测MHBs的表达。采用肌肉注射法,以各组疫苗分别对BALB／c小鼠于第0、2、4和6周进行免疫．用ELISA法检测小鼠血清中抗．HBs抗体、ELISPOT法检测小鼠表面抗原多肽特异性分泌IFN-T的脾细胞数量。结果：蛋白印迹法结果显示Adr、Adr-dN4、Adr—N4．5、Adr—N4—6、Adr-N4—7体外转染293T细胞后,均可以在293T细胞内表达,且Adr、Adr-N4—5、Adr-N4—7可将表达产物分泌到细胞外。ELISA及EISPOT结果表明：Adr免疫组小鼠抗-HBs终点滴度及表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量,均略高于其他免疫组小鼠,但与Adr—N4—5、Adr．N4—7相比无统计学差异（P〉0．05）,与Adr-dN4和Adr—N4—6组相比有显著的统计学差异（P〈0．05）。结论：在第5或7位氨基酸附加N-连接糖链,能修补或替代Asn4连接糖链引导MHBs分泌的功能。HBs表达蛋白分泌到细胞外对诱导机体产生特异性细胞和体液免疫是至关重要的。     

基因组编辑对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应

【目的】为了研究基因组编辑工具CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1所产生的DNA双链断裂(DNA doublestrandbreak,DSB)对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应情况,对比化学物质甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)对酿酒酵母基因组DNA的损伤和修复,阐明编辑细胞在细胞水平和转录水平上的变化。【方法】起始细胞分为两种情况,包括未进行细胞周期同步化和被α-因子同步化细胞周期至G0/G1期。检测CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1处理后编辑细胞的生长情况。利用流式细胞术检测编辑细胞的细胞周期延滞的情况。利用荧光定量PCR检测编辑细胞和MMS处理细胞后DNA损伤响应关键基因转录表达水平的变化情况。【结果】起始细胞无论是未同步化还是同步化,其生长均受到基因组编辑抑制,细胞存活率降低,细胞周期被滞留在G2/M期,而MMS处理导致细胞周期S期的滞留。此外,随编辑时间的延长,突变率增加,细胞存活率降低。CRISPR/Cpf1编辑细胞的突变率和存活率均低于CRISPR/Cas9,由此可见,CRISPR/Cpf1对细胞的损伤强度高于CRISPR/Cas9。两种编辑均诱导酵母DNA损伤响应关键基因RNR3及HUG1转录水平显著上调,并且CRISPR/Cpf1介导的上调幅度大于CRISPR/Cas9,但两者均低于MMS的处理。【结论】本研究解析了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1介导的基因组编辑在细胞水平和转录水平上对DNA损伤作用及修复响应,初步揭示了酿酒酵母应对不同类型的DSB损伤时响应程度的差异,为提高基因组编辑工具的编辑能力和评估基因编辑安全性提供了重要依据。     

两种测定化合物对真菌菌丝生长抑制活性方法的比较

采用带毒平板法和液体培养法测定两种植物抗菌化合物血根碱和白屈菜红碱对植物病原真菌水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporium f．sp．lycopersici）和棉花枯萎病菌（F.oxysporium f.sp．vasinfectum）的抑制活性。论文对两种测定方法进行了比较和讨论,结果发现：和带毒平板法相比,采用液体培养法获得的化合物半抑制浓度要低。     

基于前体供给途径遗传改造提高褐黄孢链霉菌纳他霉素的产量

纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂,广泛应用于食品防腐与医药领域。纳他霉素可由多种链霉菌发酵产生。它是以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A及甲基丙二酰辅酶A为前体经Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的多烯大环内酯类化合物。本研究以纳他霉素产生菌——褐黄孢链霉菌为研究材料,分别对不同前体分子供给途径中的关键酶进行过表达,并确定影响纳他霉素产量的关键前体供给途径。研究结果发现：通过过表达乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)加强乙酰辅酶A合成途径,以及通过过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)加强甲基丙二酰辅酶A合成途径,重组菌株纳他霉素产量分别比野生型菌株提高了44.19%和20.51%。共过表达ACS和MCM,重组菌株纳他霉素产量获得进一步提升(达1123.34mg/L),比野生型菌株提高了66.29%。上述发现为通过前体代谢工程的策略构建纳他霉素工业高产菌株提供了参考,也为其他聚酮类天然产物高产工程菌株的构建提供了借鉴。     

拟南芥ABA敏感突变体asm1的分离与鉴定

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为研究材料,从T-DNA突变体库中筛选分离得到1株脱落酸(ABA)敏感突变体asm1(ABA sensitive mutant 1,asm1),在含有ABA的培养基中,与野生型相比,asm1突变体的根伸长明显受到抑制,且其种子萌发结果显示asm1对ABA同样表现出敏感特性。在生长发育方面,asm1突变体抽苔时间提前,植株矮化,并且荚果长度明显小于野生型。利用远红外成像系统分析发现,在干旱胁迫下asm1突变体叶面温度高于野生型;失水率分析显示突变体失水率降低以及水分散失减少。遗传学分析表明,asm1是单基因隐性突变且与一个T-DNA插入共分离;通过图位克隆成功获得候选基因ASM1。RT-PCR结果显示,在突变体中ASM1的表达受到抑制,并且能够调控多种ABA信号通路和胁迫应答基因的表达水平。研究结果表明,ASM1可能参与调控ABA信号转导并应答干旱胁迫。