cAMP反应元件萤光素酶报告基因载体的构建简

目的：构建含有cAMP反应元件（CRE）的萤光素酶报告基因载体。方法：以含有ga14位点的萤光素酶报告基因质粒为模板,利用PCR方法,在去除ga14位点的同时,连入4个CRE元件得到pCRE-luc;将该载体与G蛋白偶联受体（GPCR）共转染人胚肾细胞HEK293,测定萤光素酶活性;应用蛋白激酶A（PKA）抑制剂确认CRE的活性是否与Gs通路相关。结果：pCRE-luc的活性直接相关于GPCR的激活程度,并依赖Gs信号通路。结论：CRE萤光素酶报告基因载体构建成功,可用于检测Gs偶联GPCR的活性,为基于GPCR的高通量药物筛选奠定了基础。     

Cajal对神经科学的贡献及当代神经生物学对Cajal理论的发展

Cajal是20世纪初期最伟大的神经生物学家之一，在Cajal的一生中，他不但建立了神经元学说，还提出了动态极化原理和连接特异性原理，并且对神经中枢的组件式筑构学，形成神经元形状的决定因素及神经胶质细胞，神经营养因子、Cajal间质细胞的认识都作出了划时代的贡献，随着现代生物医学技术进步，Cajal的上述理论不断得到证明，但是，对比Cajal的神经元时代，人们对神经系统的认识无论是在广度上还是在深度上都大大的拓展了。     

基于Te-OnAdvanced的肺癌细胞15-脂氧化酶-2基因表达载体的构建与表达

目的：构建肺癌细胞15-脂氧化酶-2（15-Lox-2）的可诱导性真核表达载体pTRE-Tight-15-Lox-2,并在肺癌细胞中检测其是否可受强力霉素（DOX）诱导表达。方法：pcDNA3-15-LOX-2载体经＆0RI和XbaI双酶切线性化,回收15-LOX-2cDNA片段,将其克隆入pTRE-Tight载体的EcoRI和XbaI位点;采用脂质体法将pTet-0n-Ad-vanced与构建的pTRE-Tight-15-Lox-2共转染肺腺癌A549细胞,DOX诱导表达后,Western印迹检测15-Lox-2的表达水平。结果：构建了pTRE-Tight-15-Lox-2诱导表达载体;Western印迹检测表明,该载体能在肺癌细胞内表达,且其表达受DOX调控。结论：Tet-OnAdvanced系统能严密高效地调控15-LOX-2在肺癌细胞中的表达,为进一步研究15-LOX-2在肺癌中的作用奠定了基础。     

重组人核因子κB亚基p65在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

将扩增得到的核因子（NF）κB亚基p65基因片段克隆至测序载体pGEM-T,测序验证该序列为预期目的片段后,再将该基因片段克隆至表达载体pGEX-4T2中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,用GST蛋白亲和柱纯化融合蛋白p65／GST。Western印迹验证该蛋白具有NF—κB抗原活性。结果表明,构建了NF—κBp65／GST融合表达载体,并表达和纯化了NF—κBp65／GST融合蛋白,为进一步研究NF-κB的功能和筛选NF—κB拮抗分子奠定了基础。     

人促肾上腺皮质激素释放因子Ⅰ型受体EC1片段在原核系统中的可溶性表达

目的:研究人促肾上腺皮质激素释放因子Ⅰ型受体(hCRFR1)EC1区蛋白片段在原核表达系统中可溶性表达的影响因素。方法:以pcDNA3.1-hCRFR1全长质粒为模板,PCR扩增EC1区分别编码118和88个氨基酸残基(分别对应融合蛋白GST-EC1118和GST-EC188)的片段,将其插入pGEX-4T2载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导目标蛋白表达;采用GSTrap FF亲和纯化柱对目标蛋白进行纯化,并用Western印迹证实。结果:与GST-EC1118相比,GST-EC188可溶性表达增加,为下一步hCRFR1相关研究的开展奠定了基础。结论:hCRFR1的EC1区M1～N19及N108～V118两个片段影响该区域在原核系统中表达的可溶性,推测可能与富含疏水性氨基酸有关。     

齐考诺肽——新一类治疗慢性疼痛的药物

在过去的40年里,治疗严重慢性疼痛一直没有理想的药物。随着对离子通道与疼痛的深入研究,现已研发出一个具有全新作用机制的肽类药物齐考诺肽（ziconotide）,它通过阻断N型钙离子通道而达到镇痛的目的。目前,齐考诺肽在欧美国家已上市,其对慢性疼痛镇痛的疗效和安全性得到确证。以N型钙离子通道为靶标研发新型慢性疼痛镇痛药受到药理研究者和临床工作者的广泛重视,这为无成瘾性镇痛药的研究指出了新的发展方向。简要阐述了齐考诺肽的结构、主要药理作用机制、应用现状及前景等。     

脊髓交感节前神经元的神经生物学特征

脊髓交感节前神经元(SPN)是一群形态各异、特性不同的神经元,具有内源性节律性电活动、递质共存及相互间缝隙连接的存在,且与多种不同类型的神经末梢相联系,提示SPN对交感传出冲动有着复杂的整合功能。     

M电流的生物学特性和生理意义

由Ｍ通道介导的Ｍ电流（Ｉｍ）,是一种时间、电压依赖性外向钾电流。许多神经递质、调质可通过激活各自与Ｇ蛋白耦联的受体,启动磷脂肌醇信息系统或其他途径影响Ｉｍ。由于Ｉｍ能有效地降低细胞的兴奋性,且广泛存在于中枢神经系统,Ｍ通道的关启对中枢神经元兴奋性及突触传递活动的调制起着重要作用。     

番茄红素环化酶基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的利用RNA干扰技术,构建靶向番茄红素环化酶基因(CarR)的干扰质粒,为选择性抑制番茄红素环化酶活性以提高番茄红素产量,奠定基础。方法用DNA重组技术将针对三孢布拉氏霉菌CarR的不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒mU6 pro中,构建CarR shRNA表达质粒重组体mU6 CarR shRNA1、2、3,转化DH5а菌株扩增。提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析。结果3个CarR shRNA表达载体mU6 CarR shRNA1、2、3经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。结论成功构建了CarR shRNA表达载体mU6 CarR shRNA,重组体的成功构建为研究CarR靶向RNA干扰番茄红素的环化打下基础。