梨木虱化学感受蛋白CchiCSP8与梨树挥发物的结合特性分析

【目的】梨木虱Cacopsylla chinensis是我国重要的梨树害虫。本研究通过分析梨木虱化学感受蛋白8(chemosensory protein 8, CchiCSP8)与梨树挥发物的结合特性，综合研究CchiCSP8的嗅觉功能，为今后阐释梨木虱定位梨树的嗅觉机理提供前期基础。【方法】采用PCR方法克隆CchiCSP8的全长开放阅读框序列，并对推导的氨基酸序列与其他半翅目昆虫CSPs进行同源比对和进化分析；构建pET30a(+)-CchiCSP8的原核表达载体，通过大肠杆菌Escherichia coli体外表达、组氨酸标签蛋白镍磁珠纯化技术和荧光竞争性结合实验，共测定了重组蛋白CchiCSP8与41种梨树挥发物的结合能力。随后对CchiCSP8进行同源建模和分子对接分析。【结果】克隆获得了CchiCSP8全长序列，开放阅读框全长426 bp，编码141个氨基酸，N端有一个包含21个氨基酸的信号肽。成熟的CchiCSP8蛋白的预测分子量和等电点分别为15.02 kD和9.77；与其他半翅目昆虫CSPs的序列比对发现，CchiCSP8具有4个保守的半胱氨酸位点，并与柑橘木虱Diaphorina citri化学感受蛋白DcitCSP11的进化关系最近；pET30a(+)-CchiCSP8在IPTG诱导下在大肠杆菌中成功表达，并通过镍磁珠纯化获得纯净的CchiCSP8蛋白；采用荧光竞争性结合实验分析重组蛋白CchiCSP8的结合特性，结果显示CchiCSP8对18种梨树植物挥发物具有不同程度的结合能力(Ki=14~30 μmol/L)，包括4种烯烃、6种醇类、4种醛类、1种酮、1种酯类和2种芳香类物质，CchiCSP8与配体的结合力表现出了随碳原子数不同而变化的特点；分子对接结果显示CchiCSP8和每个配体之间的结合能相差不大(-4.2~6.0 kJ/mol)，这与上述荧光竞争结合实验的结果一致。在CchiCSP8与不同配体结合过程中，存在多个共有氨基酸残基，其中5个非极性残基(A38， A42， L93， L99和V100)以及2个极性残基(Q107和K46)的作用最为突出。【结论】CchiCSP8能够结合18种不同类型的梨树挥发物，推测其在梨 木虱识别梨树挥发物的过程起到重要作用，本研究结果可为明晰梨木虱在定位梨树过程中的嗅觉机制提供理论基础，并为开发基于扰乱嗅觉行为的新型梨木虱行为调控技术提供新思路。