蓝藻硫酯酶催化多肽环化适用性分析

硫酯酶(thioesterase, TE)具有区域定向性（regiospecific）、化学定向性（chemospecific）及立体定向性（stereospecific）的特点。这些特性决定了TE作为生物催化剂（biocatalysis）在工业生产中具有较高的应用价值和广阔的应用前景。McyC-TE (microcystin thioesterase, McyC TE)来自铜绿微囊藻（microcystis aeruginosa）NRPS/PKS生物合成基因簇。我们利用正交试验提高McyC TE表达量,得到稳定的诱导表达条件,并结合成熟的线性多肽化学合成法对其底物适用性做了进一步研究。得到的最佳诱导表达条件为：诱导时机2 h,诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG）浓度0.75 mmol/L,诱导时间6 h,诱导转速210 r/min,诱导温度20 ℃,使TE的表达量由8.75 mg/L提高至22.15 mg/L,时间缩短了6.5 h。TE表达量的大幅度提升和表达时间的缩短为将来酶的结构及催化机制研究奠定了基础。TE底物适用性研究结果发现：McyC TE并不遵循“4 n + 2原则”;底物中转角过多不仅不利于环肽的形成,更可能形成卷曲影响环化;无D型氨基酸亦可通过加入其它位阻较小较灵活的Gly或者自带天然转角Pro的可弱化肽链的刚性,促进催化反应;含苯环的Phe的引入在一定程度上阻碍了环化;底物无肽链氨基酸数目奇偶性的选择;延长多肽链长度也可环化,McyC-TE的底物容忍度较大,使天然多肽药物筛选范围增大,也为增强天然多肽药物药效增加了改良方案,为进一步研究McyC TE的催化功能提供了实验基础。     

等温扩增技术及其结合CRISPR在微生物快速检测中的研究进展

等温扩增技术因其对仪器依赖性低、核酸扩增高效等优势,非常适合于快速检测,已在微生物快速检测领域得到了广泛应用。本文从核酸提取、等温扩增(以环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)为例)和产物检测角度,就近年来核酸等温扩增技术的发展及其在病原微生物核酸快速检测领域的应用进行综述,并概述了核酸等温扩增技术与CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑技术相结合的最新研究成果,为这些新兴技术的研究和未来的发展提供新思路。     

重组酶聚合酶扩增技术：一种新的核酸扩增策略

重组酶聚合酶扩增 (recombinase polymerase amplification, RPA)是近年来兴起的一种等温核酸扩增技术,它比聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)及其它等温扩增技术更快速、便捷、高效。本文将详细介绍RPA这项新颖的技术,并对其在医疗诊断、农业、食品、生物安全等方面的研究及应用进展进行综述。期望这项技术得到更多的关注,使其发展更加完善,将来在更多的领域充分发挥作用,甚至书写核酸检测历史新篇章。     

蓝藻硫酯酶催化多肽环化适用性分析北大核心CSCD

硫酯酶(thioesterase,TE)具有区域定向性(regiospecific)、化学定向性(chemospecific)及立体定向性(stereospecific)的特点。这些特性决定了TE作为生物催化剂(biocatalysis)在工业生产中具有较高的应用价值和广阔的应用前景。Mcy C TE(microcystin thioesterase,Mcy C TE)来自铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)NRPS/PKS生物合成基因簇。我们利用正交试验提高Mcy C TE表达量,得到稳定的诱导表达条件,并结合成熟的线性多肽化学合成法对其底物适用性做了进一步研究。得到的最佳诱导表达条件为:诱导时机2 h,诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside,IPTG)浓度0.75 mmol/L,诱导时间6 h,诱导转速210 r/min,诱导温度20℃,使TE的表达量由8.75 mg/L提高至22.15 mg/L,时间缩短了6.5 h。TE表达量的大幅度提升和表达时间的缩短为将来酶的结构及催化机制研究奠定了基础。TE底物适用性研究结果发现:Mcy C TE并不遵循"4 n+2原则";底物中转角过多不仅不利于环肽的形成,更可能形成卷曲影响环化;无D型氨基酸亦可通过加入其它位阻较小较灵活的Gly或者自带天然转角Pro的可弱化肽链的刚性,促进催化反应;含苯环的Phe的引入在一定程度上阻碍了环化;底物无肽链氨基酸数目奇偶性的选择;延长多肽链长度也可环化,Mcy C TE的底物容忍度较大,使天然多肽药物筛选范围增大,也为增强天然多肽药物药效增加了改良方案,为进一步研究Mcy C TE的催化功能提供了实验基础。