细胞培养中“黑胶虫”污染的检测及防治

很多国内的细胞培养实验室受到"黑胶虫"(或称为"胶虫"、"焦虫")污染的困扰,类似的污染在国外通常称为"纳米细菌"(nanobacteria)污染,但"黑胶虫"/纳米细菌究竟是何物种抑或是一种非生命颗粒,至今还没有定论.我们将细胞培养中的污染物从培养基中分离出来,进行培养和形态学观察,并利用16S r DNA鉴定技术及VITEK-2微生物鉴定系统对"黑胶虫"进行鉴定,最后通过抗生素敏感试验及细胞结晶紫染色技术筛选出抑制"黑胶虫"增殖的抗生素及可用于细胞培养的工作浓度.形态学观察结果显示:"黑胶虫"在普通倒置显微镜下呈点状或片状;电镜下展示为杆状,长1 300～1 600 nm,宽400～500 nm;在激光共聚焦扫描显微镜400倍镜下进行原地"布朗运动". 16 S rDNA鉴定及VITEK-2微生物鉴定系统结果显示:本实验室分离的"黑胶虫"为一株短波单胞菌属(Brevundimonas)的新菌株,该菌株与Brevundimonas diminuta的相似性为97.8%,与Brevundimonas faecalis的相似性为98.1%.抗生素敏感试验结果显示:"黑胶虫"对氯霉素(25 mg/L)、红霉素(200 mg/L)和四环素(2.5 mg/L)敏感,对氨苄青霉素(50 mg/L)、嘌呤霉素(2 mg/L)、青霉素-链霉素双抗(100×)和庆大霉素-两性霉素B双抗(100×)均不敏感.细胞结晶紫染色结果显示:细胞培养基中添加一定浓度的氯霉素(25 mg/L)、红霉素(200 mg/L)或四环素(2.5 mg/L)均可抑制细胞培养中"黑胶虫"的增殖,降低其对细胞增殖的抑制作用.综上所述,本研究分离鉴定的"黑胶虫"为一种短波单胞菌,低浓度的氯霉素、红霉素或四环素均可降低该菌对细胞增殖的抑制作用.鉴于研究的局限性,我们不排除"黑胶虫"是其他物种的可能性,但是本研究为"黑胶虫"的种属鉴定及细胞无菌化培养提供了新的研究思路及方法,并有望帮助一些实验室解决"黑胶虫"污染的困扰.     

哈氏弧菌(Vibrio harveyi)recA基因的克隆与原核表达

SOS反应不仅能够促使细菌本身产生耐药性,而且与细菌耐药基因的水平转移密切相关。rec A是细菌SOS反应的重要基因,影响SOS反应的开启和关闭。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因rec A(recombinase A),并对rec A基因进行了生物信息学分析。并构建了rec A基因的原核表达载体PGEX-rec A,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达,对Rec A蛋白的诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行了优化。结果表明,rec A基因的开放阅读框为693 bp,编码230个氨基酸,Rec A蛋白理论分子量为25.29 k D。重组蛋白表达的优化条件为37℃、0.04 mmol/L IPTG诱导6 h。