红藻氨酸诱导原代培养皮质神经元兴奋毒中p21变化及机制的研究

目的：探讨p21在红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元兴奋毒中的变化及可能机制。方法：原代培养大鼠皮质神经元经红藻氨酸（KA）处理24h后,激光共聚焦显微镜透射光下观察细胞损伤,应用Western blotting方法检测p21与p53蛋白表达的变化,用染色质免疫共沉淀（ChIP）-聚合酶链反应（PCR）方法检测p53与p21基因启动子上p53反应元件1结合情况。结果：KA处理后神经元明显损伤,部分细胞胞体缩小、变圆,突起变短、减少或消失,p21与p53蛋白表达上调,并且p53与p21基因启动子上的p53反应元件1结合增加。结论：在KA诱导的原代培养皮质神经元兴奋毒作用中p21蛋白表达上调,而p53直接参与了p21的激活。     

p21RNAi的pSUPER载体的构建及功能鉴定

目的：构建抑制p21基因表达的pSUPERRNAi载体（pSUPER—p21）并鉴定其功能。方法：化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向大鼠p21基因的寡核苷酸链,各60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒（pSUPER-p21）。通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果。将正确构建的质粒转染大鼠原代培养皮质神经元,western blotting检测经红藻氨酸处理的神经元中p21蛋白表达。结果：pSUPER-p21载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。Western blotting结果证实pSUPER-p21载体可特异性抑制红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元中p21蛋白表达的上调。结论：靶向p21的pSUPERRNAi载体构建成功,该载体可特异性抑制p21基因表达。     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283）,双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达。     

p21 RNAi的pSUPER载体的构建及功能鉴定

目的:构建抑制p21基因表达的pSUPER RNAi载体(pSUPER-p21)并鉴定其功能.方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向大鼠p21基因的寡核苷酸链,各60个碱基,退火,克隆到经Bg1 Ⅱ、HindⅢ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-p21).通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果.将正确构建的质粒转染大鼠原代培养皮质神经元,western blotting检测经红藻氨酸处理的神经元中p21蛋白表达.结果:pSUPER-p21载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.Western blotting结果证实pSUPER-p21载体可特异性抑制红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元中p21蛋白表达的上调.结论:靶向p21的pSUPER RNAi载体构建成功,该载体可特异性抑制p21基因表达.     

胸腺细胞表面岩藻糖化抗原在细胞凋亡过程中变化的初步研究

细胞表面糖在细胞分化及细胞周期中均有一定的变化,而且还与细胞间的识别与信息传递有关,为了解膜表面糖复合物在细胞凋亡过程中的作用,通过地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡为模型,利用对８种抗原结构相关的寡糖特异的单克隆抗体,观察凋亡过程中胸腺细胞表面岩藻糖化糖抗原结构的变化。免疫组化的分析结果表明：正常胸腺细胞表面的糖抗原主要是含有岩藻糖基的Ｈ－２和Ｌｅ￣ｂ．而凋亡的胸腺细胞表面出现ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌ－,Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌ－及双岩藻糖化抗原Ｌｅ￣Ｙ,同时Ｌｅ￣ｂ消失。磷脂提取结果表明在给药３ｈ后膜的ＰＳ条带明显增加,通过对诱发细胞凋亡过程中组化分析的时相变化观察发现：凋亡细胞膜表面糖抗原的变化在给药１ｈ（即凋亡发生前）就出现。以上结果说明凋亡过程中胸腺细胞表面岩藻糖化抗原发生了变化,且此变化可能与细胞凋亡的始发有关。