用于灵芝属10个物种快速鉴定的DNA条形码筛选与验证

灵芝栽培品种常出现同名异物或同物异名的现象,依赖于灵芝的形态学特征鉴定物种的传统分类方法不足以鉴定物种的种间和种内差异。为开发简便而准确的分子水平灵芝属物种鉴定方法,以常用于种属鉴定的核糖体内转录间隔区（ITS）、微管蛋白基因（β-tubulin）片段、大亚基核糖体DNA(LSU)片段和基因编码RNA聚合酶Ⅱ第二大亚基（RPB2）片段4个DNA条形码,对灵芝属10个物种的44份菌株进行PCR扩增和测序,比较4个条形码的扩增成功率和变异率,根据种内、种间遗传距离差异分析筛选特异性的DNA条形码间隔（DBG）,并利用单独及联合条形码构建系统发育树验证筛选的DBG鉴定灵芝属物种的准确性。研究结果表明：β-tubulin和LSU片段的PCR扩增成功率均达100%,ITS和RPB2片段分别为95.35%和90.91%;对比ITS和LSU片段,β-tubulin和RPB2片段的种内最大遗传距离分别小于各自的种间最小遗传距离,存在明显的DBG,有利于准确对物种进行种间鉴定;利用ITS、β-tubulin和RPB2片段分别构建的系统发育树均能使灵芝属10个物种的所有个体聚为1个单系分支,而LSU片段不...     

来源于马赛菌(Massilia sp.) UMI-21的ACSMU和PhaCMU体外表达及功能研究

【目的】构建马赛菌(Massilia sp.) UMI-21来源乙酰辅酶A合成酶ACS_MU和聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate, PHA)合酶PhaC_MU的体外重组表达体系并过表达2种酶,利用体外合成体系确定2种酶在Massilia sp. UMI21聚3-羟基丁酸(polyhydroxybutyrate, PHB)合成途径中的主要功能。【方法】利用无缝克隆技术将来源于Massilia sp. UMI-21的乙酰辅酶A合成酶基因acs_MU和PHA合酶基因phaC_MU扩增后与pQE-80L质粒连接,转导大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)构建2个基因的重组表达体系;利用6×His标签纯化蛋白ACS_MU和PhaC_MU,并采用5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸) [5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB]法测定其活性;使用体外单相合成系统(one-phase reaction system, OPRS),以(R)-3HB为底物,验证ACS_MU和PhaC_MU这2种酶在合成PHB途径中的功能。【结果】成功构建了ACS_MU和PhaC_MU蛋白重组表达菌株BL21-pQE-80L-acs_MU和BL21-pQE-80L-phaC_MU,提纯得到过表达蛋白ACS_MU和PhaC_MU产率分别为24.8 mg/L和25.6 mg/L;ACS_MU酶比活力为(0.148±0.011) U/mg。PhaC_MU酶对(R)-3HBCoA的比活力为(0.102±0.011) U/mg;核磁共振氢谱(nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy, ¹H-NMR)分析结果表明,使用ACS_Pt-PCT_CP-PhaC_Re、ACS_MU-PCT_CP-PhaC_Re和ACS_MU-PCT_CP-PhaC_MU这3条OPRS途径均能合成PHB,产量分别为0.62、0.76和0.64 g/L。【结论】acs_MU和phaC_MU基因可利用大肠杆菌表达体系过表达并可获得具有活性的可溶性蛋白;对比ACS_Pt-PCT_CP-PhaC_Re合成体系,ACS_MU替代ACS_Pt合成PHB产量增加22.58%,在聚合酶相同的情况下,PHB的合成产量依赖乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase, ACS)合成乙酰辅酶A的稳定性。使用PhaC_MU代替PhaC_Re,对比ACS_MU-PCT_CP-PhaC_Re组合,合成PHB产量减少了15.79%。在聚合前体浓度相同的情况下,PHB合成量依赖聚合酶的活性。