苹果蠹蛾NAPDH-细胞色素P450还原酶(CPR)基因的克隆及表达模式分析

【目的】本研究通过克隆苹果蠹蛾Cydia pomonella CPR (CpCPR)基因cDNA序列,并对该基因的表达模式进行分析,为深入研究P450酶系在苹果蠹蛾对植物次生物质和杀虫剂解毒代谢过程中的作用提供理论基础。【方法】以近缘昆虫的CPR氨基酸序列作为询问序列,在苹果蠹蛾转录组(SRX371333)中进行筛查比对,获得了苹果蠹蛾CPR(CpCPR)基因的cDNA序列。采用RT-PCR技术克隆目的基因的开放阅读框(ORF)。利用生物信息学软件分析目的基因的序列特征、3D结构和与其他昆虫CPR基因的系统进化关系。采用RT-qPCR技术测定CpCPR基因在苹果蠹蛾不同发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)及幼虫不同组织部位(头部、表皮、脂肪体、中肠和马氏管)的表达水平。【结果】克隆获得的苹果蠹蛾CpCPR基因的ORF为2 052 bp,编码683个氨基酸残基,预测的蛋白质分子量(Mw)为77.326 ku,理论等电点(pI)为5.65。CpCPR包含FMN区域、NADPH区域和FAD等昆虫CPR的典型特征。系统发育分析表明,苹果蠹蛾CpCPR与鳞翅目昆虫CPR基因聚在一枝。RT-qPCR结果表明,CpCPR基因在苹果蠹蛾的整个发育阶段均有表达,在幼虫期表达量最高;CpCPR基因在4龄幼虫的各部位均有表达,在中肠中的表达量最高。【结论】克隆获得了苹果蠹蛾CpCPR基因的ORF序列,该基因在苹果蠹蛾主要取食阶段和消化器官中高表达,表明其可能在苹果蠹蛾对植物次生物质和杀虫剂解毒代谢过程中扮演重要作用。     

苹果蠹蛾细胞色素P450基因CYP332A19和CYP337B19的克隆及表达分析

【目的】本研究旨在通过克隆苹果蠹蛾Cydia pomonella细胞色素P450基因CYP332A19和CYP337B19,并对其进行序列和表达分析,以更好地了解这两个P450基因在植物次生物质解毒方面的作用,为进一步的功能研究提供依据。【方法】采用本地BLAST搜索苹果蠹蛾转录组数据库获得细胞色素P450基因cDNA序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因的编码区。利用生物信息学软件分析目的基因的序列特征及与其他近缘物种的P450基因的系统进化关系。采用RT-qPCR技术测定目的基因在苹果蠹蛾不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和成虫)、4龄幼虫不同组织(头部、表皮、脂肪体、中肠和马氏管)以及4龄幼虫分别取食添加0.1%香豆素和0.5%槲皮素的人工饲料2 d后的表达水平。【结果】克隆获得苹果蠹蛾细胞色素P450基因CYP332A19(GenBank登录号: MF574708)和CYP337B19(GenBank登录号: MF574697)的全长cDNA序列,开放阅读框(ORF)分别长1 518和1 491 bp,分别编码505和496个氨基酸,其蛋白质分子量分别为58.586和57.734 kD,理论等电点分别为8.99和7.61。结构域分析显示,CYP332A19和CYP337B19中均包含包括血色素结合区在内的5个保守的细胞色素P450结构域。系统发育树显示,苹果蠹蛾CYP332A19与苹淡褐卷蛾Epighyas postvittana CYP332A9等CYP332A基因聚在一枝,而CYP337B19与稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis CYP337B12和六星灯蛾Zygaena filipendulae CYP337B11等CYP337B基因聚在另一枝。RT-qPCR分析结果表明,CYP332A19和CYP337B19在苹果蠹蛾幼虫期的表达水平高于卵期的,分别在4龄幼虫脂肪体和中肠中的表达量最高。取食分别含0.1%香豆素和0.5%槲皮素的人工饲料2 d后,4龄幼虫体内的CYP332A19和CYP337B19相对表达量显著高于对照组(取食含2%DMSO的人工饲料)。【结论】CYP332A19和CYP332B19分别在苹果蠹蛾幼虫脂肪体和中肠中高表达,且在取食含香豆素和槲皮素的人工饲料的苹果蠹蛾幼虫体内表达量升高,说明这两个基因可能参与苹果蠹蛾对外源物质的解毒代谢过程。本研究的结果有助于我们了解苹果蠹蛾对寄主次生物质解毒代谢机理,为苹果蠹蛾防治提供新思路。