SDF-1/CXCR4信号通路介导的低浓度过氧化氢对间充质干细胞促增殖、迁移作用及其机制

该文探讨了低浓度过氧化氢(H_2O_2)对骨髓间充质干细胞增殖、迁移及其相关信号通路的影响,阐明了低浓度H_2O_2发挥生物学效应的分子机制,为临床应用提供了可靠的实验证据。通过差速贴壁分离培养小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)。流式细胞术鉴定第三代BMSCs表面标志物。采用随机数字表法分组,以不同低浓度H_2O_2(0、25、50、100、150、200μmol/L)处理BMSCs 24 h,应用甲氮甲唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测干细胞表面标志物以及凋亡率,划痕实验和Transwell实验检测H_2O_2对细胞迁移能力的影响。Western blot检测细胞老化相关蛋白质p16和Cyclin D1、基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)与其受体CXCR4(CXC chomekine receptor 4)的表达以及相关下游信号通路PI3K/AKT/mTOR关键蛋白质的表达。流式细胞术检测结果显示,BMSCs细胞表面分化抗原CD29、CD44为阳性,CD34、CD45为阴性。MTT检测结果显示,与对照组相比,25和50μmol/L H_2O_2能有效促进BMSCs增殖(P0.05)。划痕实验和Transwell实验检结果显示,50μmol/L H_2O_2处理细胞能促进其迁移能力。流式细胞术检测显示,25、50和100μmol/L H_2O_2对干细胞凋亡无影响,150和200μmol/L H_2O_2则显著促进细胞凋亡(P0.01);25和50μmol/L低浓度H_2O_2处理干细胞能抑制老化相关蛋白质p16表达下降(P0.05,P0.01),相反,细胞周期蛋白Cyclin D1表达则显著升高(P0.05,P0.01),H_2O_2为200μmol/L时,p16表达上调(P0.01),而Cyclin D1下调(P0.01);同样,25~100μmol/L H_2O_2能增强细胞SDF-1和CXCR4的表达(P0.05)以及上调下游信号通路关键蛋白质PI3K、AKT、mTOR的磷酸化水平(P0.05)。结果表明,低浓H_2O_2度通过活化干细胞SDF-1/CXCR4信号轴,活化其下游PI3K/Akt/mTOR信号通路,促进干细胞增殖和迁移。     

嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(IP)对RAW264.7细胞自噬的影响

【目的】观察嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(immunogenic protein,IP)对RAW264.7细胞自噬流及自噬相关因子表达水平的影响并探讨其作用机制。【方法】采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(IP),并用CCK-8法检测IP对RAW264.7细胞半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC₅₀)。采用低浓度(0.05×IC₅₀)、中浓度(0.1×IC₅₀)、高浓度(0.2×IC₅₀) IP与RAW264.7细胞进行体外共培养1、3、6、12 h,并设细胞对照组,应用自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测巨噬细胞自噬流的变化,筛选最佳浓度进行后续实验;最佳浓度IP与RAW264.7细胞进行体外共培养6、12、24 h,并设细胞对照组,RT-qPCR检测各组自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、SQSTM 1 (sequestosome 1,p62)及组蛋白去乙酰化酶6 (histone deacetylase 6,HDAC6)的mRNA表达水平;Western blotting法检测各组自噬相关因子的蛋白表达水平;免疫荧光检测各组自噬相关因子的表达。【结果】根据CCK-8结果计算IC₅₀为0.26μg/μL。自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测自噬流结果显示,与对照组相比,中浓度(0.026μg/μL) IP与RAW264.7细胞进行体外共培养后自噬流抑制显著。RT-qPCR及Western blotting检测结果显示,与对照组相比,IP与RAW264.7细胞共培养6 h,P62表达水平升高,LC3B、HDAC6、Beclin1表达水平均降低,P<0.05;与6 h组相比,12 h组LC3B表达水平降低,P62、HDAC6及Beclin1表达水平均升高,P<0.05;与12 h组相比,24 h组Beclin1表达水平升高,P<0.05。IP一定程度上以时间依赖的方式降低了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值并升高了P62蛋白的表达水平,P<0.05。免疫荧光结果基本与RT-qPCR及Western blotting检测结果一致。【结论】嗜肺军团菌IP抑制巨噬细胞自噬,可能与通过影响自噬小体-溶酶体融合途径,干扰自噬小体及自噬溶酶体的形成、成熟等过程有关。