蛋白质内含子介导蛛丝功能化平台的建立

为建立高效快捷的蛛丝功能化修饰平台,蛋白质内含子的反式剪接技术被首次应用于重组蛛丝的功能化修饰。在体外通过Ssp Dna B的反式剪接作用,在蛋白质水平上将12 k Da泛素相关修饰蛋白(SUMO)与蛛丝蛋白(W2CT)连接形成功能化蛛丝蛋白SUMOW2CT。修饰后SUMOW2CT与W2CT均能形成纳米至微米级的丝纤维,但SUMOW2CT自动成丝速度明显下降且产量约为W2CT的一半。与W2CT丝纤维(W)相似,SUMOW2CT丝纤维(UW)不具有超收缩能力和对2%SDS不耐受,但机械性能低于W2CT丝纤维。功能化蛋白SUMOW2CT形成的丝纤维中SUMO蛋白仍保持着正确三维结构,可被SUMO蛋白酶酶切。外源功能化蛋白质虽在一定程度上降低了丝的形成速度和机械性能,但修饰上的功能化蛋白仍保持着生物活性,表明断裂蛋白质内含子介导的蛛丝修饰平台成功建立,也为蛛丝的功能化修饰和应用奠定了坚实的技术基础。     

盐离子对次壶腹腺丝蛋白重组模块的影响

为研究不同生理环境对蛛丝蛋白组装及成丝的影响,首次以MiSp序列为对象,研究其NTR1SR2CT重组模块在不同种类(浓度)盐离子条件下的聚集和成纤维特性及其在成纤维过程中二级结构的变化。基于大腹园蛛MiSp全长序列构建NTR1SR2CT模块,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21中成功表达。借助8 mol/L尿素裂解包涵体进行变性纯化得到NTR1SR2CT重组蛋白。NTR1SR2CT重组蛋白二级结构主要为无规则卷曲(Random coil)或α螺旋(Helix),在自然成丝及冻干过程中部分random coil或helix转变为β折叠(β-sheet),甲醇能促进该转变过程。另外,钾离子和磷酸根离子有利于NTR1SR2CT重组蛋白聚集从而促进丝纤维的形成。研究结果为成丝机理研究奠定了基础,同时也为工业化生产高品质的蛛丝纤维提供了条件。     

Euprosthenops australis牵引丝蛋白的原核表达

参照GenBank收录的牵引丝蛋白编码序列,经过密码子优化,人工合成3段cDNA序列:NT、CT和4Rep,由Ⅰ型限制性内切酶BsaⅠ和BspMⅠ介导无缝拼接,分别构建4RepCT、NT4RepCT、NT8RepCT和NT12RepCT重组模块.通过改造表达载体和优化培养温度,成功提高了4RepCT的表达量(30 mg/L).另外还首次成功表达NT4RepCT和NT8RepCT重组蛋白模块,表达量分别为21 mg/L和8.5 mg/L.4RepCT表达量的提高及NT4RepCT和NT8RepCT的成功表达证实了融合标签TRX有利于提高蛛丝蛋白的表达水平,为E.australis全长牵引丝蛋白的表达奠定了基础.     

重组蜘蛛丝蛋白MiSp NT结构域在不同pH环境下的Trp荧光光谱及圆二色谱分析

为明确蛛丝蛋白NT结构域的生物学功能,首次研究了MiSp NT结构域在不同pH条件下的二聚化动力学及二级结构特性. 基于蛛丝蛋白MiSp全长编码基因,克隆并分别在BL21(DE3)和Rosetta-gami 2(DE3)中重组表达MiSp NT结构域: BL21(DE3)表达水平较高,约35 mg/L LB培养基,表达产物需经短暂超声和2 mol/L尿素促溶;Rosetta-gami 2(DE3)表达产物可溶性较好,但表达水平仅为BL21 (DE3) 一半左右. 融合蛋白经凝血酶介导的2次Ni-NTA纯化,纯度达到95%以上. Trp 荧光光谱分析表明,MiSpNT在pH为7.0左右时开始二聚化,pH5.7时二聚体为主要构象,pH_T约为6.6. MiSp NT在pH 7.5,6.5和5.5条件下的CD图谱相似,均主要为α-helix,表明NT二聚化与二级结构水平的变化没有直接联系. 本研究为进一步探索蛛丝蛋白NT结构域的结构和功能以及成丝机理提供线索.     

蜘蛛HMW-gDNA的电洗脱纯化提取

该文研究了蜘蛛大分子量基因组DNA（HMW-gDNA）的提取以及一种高效电洗脱纯化装置的构建。以蜘蛛胸部肌肉组织为原料,通过自改良CTAB法提取蜘蛛HMW-gDNA,利用透析膜和2 mL离心管构建一种新的HMW-gDNA快速凝胶回收装置,并对蜘蛛HMW-gDNA进行电洗脱分离回收。结果显示,改良CTAB法可高效提取蜘蛛HMW-gDNA（>48.5 kb）,且通过透析膜的截留作用,对普通琼脂糖凝胶中目的HMW-gDNA进行快速电洗脱分离,其回收率超过75%,OD₂₆₀/OD₂₈₀处于1.8～2.0之间,对HMW-gDNA完整性无影响。综合结果表明, 改良CTAB法可用于蜘蛛HMW-gDNA的提取,此电洗脱纯化装置可从普通琼脂糖中高效回收HMW-gDNA,是一种低成本、简捷、高效且实用性强的凝胶回收方法。     

大腹圆蛛Fosmid文库的构建及MaSp基因筛选方法的探讨

介绍了构建大腹圆蛛Fosmid基因组文库及牵引丝蛋白(MaSp)基因克隆筛选的全过程.采用改良CTAB法提取大片段基因组DNA,通过自主构建的电洗脱核酸回收装置分离回收30～40kbDNA片段,经补平磷酸化、与pCC2FOS载体连接、体外包装和转染EPI300TM-T1R,首次构建了无偏向性的大腹圆蛛Fosmid文库,其滴度为4.5×105cfu/mL,覆盖基因组倍数为10.以α-32P标记寡核苷酸探针对文库进行初步筛选,获得含MaSp基因的12个阳性克隆.该文库符合Fosmid文库的品质要求,为进一步筛选并研究大腹圆蛛MaSp基因序列奠定了基础.     

次壶腹腺丝蛋白功能模块的研究

蜘蛛丝是天然的生物材料,具有潜在的巨大应用价值。研究蜘蛛丝蛋白质的结构与功能,有助于破解蜘蛛丝蛋白质的成丝机理,为制备优良材料学性能的仿生蜘蛛丝纤维提供理论依据。以MiSp蜘蛛丝的重复区和C端非重复区蛋白多肽为研究对象,在不同pH值和离子条件下,在体外研究其二级结构与成丝的关系。CD图谱显示:表达纯化的重组蜘蛛丝蛋白R1R2在pH 7.5、6.5和5.5时二级结构相似,均为无规则卷曲,而R1R2CT则主要呈现为α螺旋构象;扫描电镜结果表明:在以上3种pH条件下,只有pH 5.5时R1R2和R1R2CT才形成重组丝纤维,R1R2CT纤维形态较平整,类似于天然蛛丝纤维形态,而R1R2丝纤维则呈条带状,表面粗糙。另外,氯化钠不利于形成形态平整的丝纤维。该成果为研究蛛丝蛋白的成丝机理奠定基础,也为制备仿生蛛丝蛋白纤维提供理论依据。     

DNA展示系统介导的断裂蛋白质内含子体外定向进化方法的研究

蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中,生物素化基因在人工细胞中与其表达的融合蛋白（内含子C端-外显子-生物素结合蛋白）形成DNA 蛋白质连接体。只有能与后续加入的N端蛋白质内含子前体（Flag-内含子N端）发生剪接反应的DNA 蛋白质连接体,才能被加上旗帜标签（Flag）,从而被抗旗帜标签抗体纯化柱（Anti Flag antibody M2 agarose）筛选富集。为了验证该系统的可行性,实验构建了2个基因,即含有具剪接活性的蛋白质内含子的阳性基因IRC和含有不具剪接活性的蛋白质内含子的阴性基因IRCM。实验首先通过Western印迹和琼脂糖凝胶电泳证明,人工细胞中的体外转录翻译系统不仅可高表达500个氨基酸的蛋白质,而且表达的蛋白中内含子仍保持原有的剪接能力。生物素结合蛋白能结合95%的DNA,并且形成的DNA 蛋白质连接体可以被筛选富集,最终证明了该系统用于断裂蛋白质内含子定向进化筛选的可行性。随后,为了检测系统的富集效率,制备了人为的基因“突变库”,即将基因IRC和IRCM以摩尔比1:10的比例混合,经过2轮筛选后,阳性基因IRC可以被10倍富集,进一步证明了体外筛选方法的可行性。该方法为后续针对不同宿主进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选方法支持,也为断裂蛋白质内含子的在生物技术和研究领域的应用奠定了基础。     

大腹园蛛次壶腹腺丝的表达

基于大腹园蛛次壶腹腺丝Minor Ampullate Spidroin全长编码基因最新报道,研究了该基因的表达。利用PCR扩增该基因重复区一段长1 348 bp的片段P1,融合his-tag标签,构建酵母表达载体,在毕赤酵母菌GS115进行表达。同时构建大肠杆菌表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,P1在两种表达系统中均可实现表达。研究结果显示:P1在GS115中的表达经优化后产量、产率有较大提高,且远高于BL21(DE3)中的表达,相应的纯化效率GS115也远高于对照BL21(DE3)的表达。研究表明酵母表达系统更适合重复度高、且富含Gly/Ala的天然蛛丝蛋白基因的表达,为表达全长天然MiSp编码序列提供前期实验基础,也为大规模蛛丝蛋白的重组表达建立了平台。